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Ficoll密度梯度离心法提取PBMC原理及注意事项


外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear CellPBMC),是指外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞(Lymphocyte)、单核细胞(Monocyte)、树突状细胞(DC)和其他少量细胞。PBMC通过健康人或动物供体的外周血,通过Ficoll密度梯度离心法IPHASE/汇智和源),磁珠分选等步骤获得。
  Ficoll是蔗糖的多聚体,中性,平均分子量400,000,当密度为1.2g/mL,未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。

 

 

PBMC中不同细胞类型的比例

PBMC中大部分都是淋巴细胞,包括B细胞和T细胞,其中CD3 T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始(naive)状态,即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中,只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞,单核细胞的比例在10-30%,收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低,只有0.1-0.2%,因此很难从全血样本中分离到。

 

 

 

一、外周血单个核细胞(PBMC)制备方法

1.设备与试剂

全血 (以10ml为例)

无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水

蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS)

RPMI 1640培养基

胎牛血清(FBS

双抗P/S Penicillin/ Streptomycin)

二甲亚砜(DMSO

预先装好异丙醇的冻存盒

 

2.方法/步骤

配制所需的溶液:
a. 细胞培养基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S
b. 细胞冻存液:FBS中加入10%DMSO


1)将10ml全血转入50ml离心管中,加入10ml PBS溶液稀释,轻轻混匀;
2)取两支15ml离心管,先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层,一定要轻柔,避免两种溶液混合在一起,每只离心管各10ml稀释血液;
32,000rpm20min,注意,降速设置中一定要设置成no break,或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层;

4PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。

5)加入PBS10-15ml1,500rpm10min离心后去掉上清,再加入培养基进行相同操作的清洗;

6)加入5-10ml培养基重悬细胞,进行后续计数培养或者铺板;

7)细胞冻存:将细胞离心收集之后,用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中,放入冻存盒(冻存盒可事先在4℃冰箱预冷)。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。

 

 

IPHASE/汇智和源建议操作注意事项

1)全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层,但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

2)分离PBMC第一步离心的时候,一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。

3)人PBMC和动物PBMC分离方法稍有不同,动物PBMC需求可联系IPHASE/汇智和源。

 

细胞运输与保存

(1)干冰运输,收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏;

(2)T25瓶运输的新鲜细胞,收到后应继续生长,传代达到细胞生长状态良好时,再进行冻存,具体操作步骤见细胞培养步骤。

 

PBMC收到后注意事项

1收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好,培养液是否有漏液、浑浊等现象,若有上述现象发生请及时反馈

2)先不打开瓶盖,瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时,稳定细胞状态,切忌在温箱内静置过夜。

3静置后镜检,拍照,记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。

(4)贴壁细胞:若细胞密度超过80%,可正常传代;若未超过80%,收集细胞瓶内的培养基,留8ml继续培养至80%左右再传代,瓶盖可稍微拧松。

5细胞瓶内的培养基含血清和双抗,可收集后4℃保存备用,可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基,一半用自备的培养基,使细胞逐渐适应培养条件,以免因不适应而造成生长状态不佳。

6细胞胰酶消化液建议使用PBS配制

 

IPHASE/汇智和源其他外周血单个核细胞:

人外周血单个核细胞 Human PBMC

猴外周血单个核细胞 Monkey PBMC

比格犬外周血单个核细胞 Dog PBMC

大鼠外周血单个核细胞 Rat PBMC

小鼠外周血单个核细胞 Mouse PBMC

兔外周血单个核细胞 Rabbit PBMC

猪外周血单个核细胞 Pig PBMC