体外哺乳类细胞微核试验原理及注意事项

体外哺乳类细胞微核试验原理及注意事项

 

微核试验是遗传毒性研究标准组合试验之一，在食品，化学品，药品，农药，饮用水等多类产品的遗传毒性评价方面得到广泛应用。与体内实验相比，体外微核试验更加简单快速，避免动物个体差异影响，灵敏度高。体外微核试验主要包括体外哺乳类细胞微核试验，人外周血淋巴细胞微核试验，肝原代细胞微核试验等类别。

体外哺乳类细胞微核试验是一种用于检测哺乳类细胞在受试物处理后是否产生微核的遗传毒性检测方法。该试验适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和诱发非整倍体的能力。如果3h~6h短期处理的试验结果为阴性或不确定时，需要进行无代谢活化系统的长期处理试验，相当于用受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期。

 

参考导则：

GB 15193.28-2020 食品安全-国家标准 体外哺乳类细胞微核试验

一、仪器、试剂

仪器

细胞培养箱、倒置显微镜、正置显微镜、超净台、离心机。

代谢活化系统

1.1 S9辅助因子的配制

1）  镁钾溶液

氯化镁1.9 g和氯化-钾6.15 g加蒸馏水溶解至100 ml。

2）  0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄，28.4 g/L)440 mL,磷酸二氢钠(NaH₂PO_4·H2O,27.6 g/L)60 mL，调pH 至7.4，0.103 MPa 20 min灭菌或滤菌。

3）  辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液

无菌条件下称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液，现用现配。

4）  葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液

称取葡萄糖-6磷酸钠盐,用蒸馏水溶解配制成0.05 mol/L 溶液，过滤灭菌。现用现配。

1.2 大鼠肝S9组分的诱导和配制

选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g~200g，约5周龄~6周龄。将多氯-联-苯(Aroclor 1254)溶于玉米油中，浓度为200 g/L，按500 mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射，5 d后处死动物，处死前禁食12 h。

也可采用苯-巴-比-妥-钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯-巴-比-妥-钠和β-萘黄酮，剂量均为80 mg/kg体重，连续3d，禁食16 h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。

S9组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超过40 mg为宜，并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于-80°C低温或冰冻干燥，保存期不超过1年。

1.3  S9混合液的制备

S9混合液浓度一般为1%~10%，实际使用浓度可由各实验室决定，但需对其活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性。

一般由S9组分和辅助因子按1:9组成10%的S9混合液，无菌现用现配。10%S9混合液10mL配制方法如下:取上述磷酸盐缓冲液6.0 mL、镁钾溶液0.4 mL、葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液1.0 mL、辅酶 II溶液1.6 mL、肝S9组分1.0 mL，混匀，置冰浴中待用。

1.4  肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B(CytochalasinB，cytoB)溶液

用二甲基亚砜( DMSO)配制适当浓度的储备液，避光冷藏保存。cytoB的终浓度通常为3μg/ mL ~6μg/mL，实验室应根据各种细胞系选择cytoB的适当终浓度，以达到理想的双核细胞出现频率。

1.5  0.075 mol/L氯化-钾溶液

5.59 g氯化-钾加蒸馏水至1000 ml。

1.6  固定液

甲醇:冰醋酸为3:1，临用前配制。

1.7  姬姆萨(Giemsa)染液

取姬姆萨染料3.8 g ，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375 mL，待完全溶解后，再加 125 mL甘油，放入37° C温箱中保温48 h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，2周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时,取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)混合,配成其应用液.现配现用。

磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L，pH 6.8)配制方法如下：

1）一液：取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)9.47 g溶于1000 mL去离子水中，配成1/15 mol/L溶液；

2） 二液：取磷-酸二氢-钾(KH₂ PO₄ )9.07 g溶于1 000 mL去离子水中，配成1/15 mol/L溶液；

3） 取一液50 mL加于二液50 ml中混匀，即为pH 6.8的1/15 mol/L磷酸盐缓冲液。

二、 试验方法

2.1受试物

固体受试物应溶解于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度使用。受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。

2.2 细胞

可选用中国仓鼠肺细胞株(V79、CHL)或卵巢细胞株(CHO)、小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)、人外周血淋巴细胞株(如TK6)和原代培养细胞。推荐使用CHL或L5178Y细胞株。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。汇智泰康体外微核试验试剂盒推荐使用中国仓鼠肺细胞株（CHL）。

2.3试验方案选择

试验分为使用和不使用cytoB两种方案。

方案一：在细胞经过受试物处理，有丝分裂前使用cytoB，然后观察分析已完成一次有丝分裂的细胞(双核细胞)微核率。当选用人类淋巴细胞时,建议采用方案一，因为不同来源的细胞周期不同，而且不是所有的细胞都对植物血球凝集素(PHA)有反应。

方案二：不使用cytoB，细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率。如果有证据表明受试物干扰cytoB的活性，或cytoB可能影响细胞的生长(如小鼠淋巴瘤细胞株)，建议采用方案二。

2.4 剂量

1） 剂量设置

至少应设置3个检测剂量。受试物没有细胞毒性时，从高剂量往下设至少2个剂量，一般情况下间隔系数可为2~3；有细胞毒性时，其剂量范围应涵盖从55%士5%的细胞毒性到几乎无细胞毒性。

2） 高剂量的选择

决定高剂量的因素是细胞毒性、受试物的溶解度以及pH、渗透压。

受试物有细胞毒性时，高剂量应能引起55%士5%的细胞毒性；如果没有细胞毒性或沉淀，高剂量应是5 μL/mL、5 mg/ml或10 mmol/L。

对溶解度较低的物质.当达到大溶解浓度时仍无毒性，则高剂量应是在终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。

3） 细胞毒性的确定，

在S9存在和不存在两种条件下依据细胞完整性和生长情况的指标来确定细胞毒性。

方案一，使用cytoB，细胞毒性的确定可依据复制指数(ReplicationIndex,RI)或胞质分裂阻断增殖指数( Cytokinesis Block Proliferation Index,CBPD)。

4） 阳性对照

阳性对照物包括染色体断裂剂和非整倍体剂。加S9时，断裂剂可以选用环磷酰胺和苯并(a)芘；不加S9时，断裂剂可以选用阿糖胞苷、si裂霉素C、甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉；非整倍体剂只用于不加S9时，可以选用秋水仙素和长春新碱。

如果短期处理试验方案在S9存在和不存在两种条件下都选用断裂剂作为阳性对照，那么长期处理试验方案应该选用非整倍体剂作为阳性对照。如果选用的细胞本身具有代谢能力，则不需要另外添加S9，阳性对照应该同时使用断裂剂和非整倍体剂。

5） 阴性对照

溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响组胞存活和S9活性。优先选溶媒是培养液(不含血清)或水。使用水作为溶媒时其体积不应大于总体积的10%。DMSO也是常用溶媒，但终浓度不应大于1%。

6） 空白对照

如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照

2.5试验步骤

1） 细胞准备

将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中，以收获细胞时，培养皿(瓶)的细胞未长满为标准，贴壁细胞一般以长到85%左右为佳。

2） 受试物处理

应用方案一，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗细胞，加入无血清培养液及一定浓度的受试物(需代谢活化者同时加人S9 mix)，置于培养箱中3h~6h；结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞，加人含10%血清的新鲜培养液和cytoB，继续培养1.5个~2.0个正常细胞周期后收集细胞。

对于淋巴细胞，有效的方法是在有丝分裂原(如PHA)刺激后44h~48h开始受试物处理，这时细胞开始进入分裂周期。

如果3h~6h短期处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无S9的长期处理试验，用cytoB和受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期，在处理结束后收集细胞。

如果已知或怀疑受试物(如核苷类物质)可能影响细胞周期(特别是P53活性细胞)，则细胞收获时间应该再延长1.5 个~2.0个正常细胞周期。

应用方案二，与应用方案一处理方法相同，只是不加cytoB。

3） 收获细胞与制片

每次培养都应单独收获细胞和制片，如果细胞混合液的分散度良好则不需要进行低渗处理。

a、消化

贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放人离心管以800r/min~1 000r/min的速度离心5 min，弃去上清液。悬浮细胞不需要消化，直接离心。.

b、低渗

加入0.075 mol/L氯化-钾溶液2 mL，用滴管将细胞轻轻地混匀，放人37°C细胞培养箱中低渗处理 1 min~5 min.

固定

加入2 mL固定液，混匀后固定5 min以上，以800 r/min~1 000 r/min的速度离心5 min，弃去上清液。重复一次，弃去上清液。

c、滴片

加人数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。

d、染色

推荐用姬姆萨染色(5% ~10%姬姆萨染液，15 min~ 20 min),，也可用DNA特异性荧光染料(如: 吖啶橙或Hoechst  33258)。

如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交(FISH)或引物原位标记等方法。

4） 阅片

a、微核的判断标准：微核一般为圆形或椭圆形，直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。

b、应用方案一，每个剂量组至少分析2000个双核细胞，计算微核细胞率(一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作一个含微核细胞)。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。对不规则的双核细胞(如两个核大小相差悬殊)和多于两个核的细胞不进行分析。

c、应用方案二，每个剂量组至少分析2 000个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。

三、数据处理和结果判定

 

3.1 数据处理

数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与空白对照组、阴性对照组(溶媒对照组)、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法(如X²检验)进行处理。

3.2结果判定

下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果；

a)受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关;

b) 受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。

四、试验解释

阳性结果表明受试物在该试验条件下可引起所用哺乳类细胞染色体损伤，微核细胞率增加。阴性结果表明在该试验条件下受试物不引起所用哺乳类细胞染色体损伤。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。

 

体外微核试验试剂盒

北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞微核试验开发体外微核试验试剂盒，本试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞微核试验所需的主要试剂和细胞，快速检测受试物是否有导致染色体断裂和诱发非整倍体的情况，从而评价受试物的遗传毒性，试剂盒的使用可以大大节约实验人员的准备时间。

【产品组成】

5mL×32体系/盒。

组分	规格	数量	使用说明	保存条件
中国仓鼠肺细胞（CHL）	1 mL	1	贴壁生长	-70℃
S9混合物	1.2mL	1	冰浴融化
S9 PS 反应液	10mL	1	使用前混匀
S9 CS 反应液	0.5mL	1	使用前混匀
环磷酰胺（CP） （CAS：6055-19-2）	0.2 mL	1	使用前混匀
si裂霉素C（MMC） （CAS：50-07-7）	0.1mL	1	使用前加入300 μL灭菌蒸馏水混匀
秋水仙素	0.2 mL	1	使用前混匀
细胞松弛素B（cytoB）	540 μL	1	使用前用无菌的1260 μL PBS稀释，混匀

【产品使用说明】

1、细胞复苏

收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。

从-70冰箱取出细胞，于37℃水浴融化，离心，弃上清，用含10%牛血清RPMI 1640培养液（RPMI-10）中重悬细胞后，再次离心；弃上清，用RPMI-10重悬后接种于细胞培养瓶，于37℃二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为1:3。

2、细胞准备

将处于对数生长期，贴壁生长良好的细胞用胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化处理制成细胞悬液，5mL/瓶接种于25cm²细胞培养瓶中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中加湿培养约24 h-48h。

3、染毒处理

吸去培养瓶中培养液，加入一定浓度的受试物、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，于培养箱中处理3h。弃去处理液，使用PBS洗涤细胞2~3次，换液后，按1%的比列加入细胞松弛素B（如4.95mL RPMI-10+0.05mL cytoB）。具体试验方案见下表

1）10%S9混合液配制

10%S9混合液配制（11mL）
S9混合物	1.2mL	现配现用。使用过程中，于冰浴条件下保存。 试验结束后，剩余溶液应丢弃，不可重复使用。
S9 PS反应液	0.4mL
S9 CS反应液	补足至10mL

2）推荐染毒培养体系配制方案

处理方式	组别	培养液体积（mL）	S9混合液体积（mL）	受试物体积（mL）	溶剂体积（mL）	阳性对照体积（mL）
						CP	MMC	秋水仙素
活化 3h	阳性对照	4.45	0.5	/	/	0.05	/	/
	剂量1	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
	剂量2	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
	剂量3	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
	溶剂对照	4.45	0.5	/	0.05	/	/	/
不活化 3h	阳性对照1	4.95	/	/	/	/	0.05	/
	阳性对照2	4.95	/	/	/	/	/	0.05
	剂量1	4.95	/	0.05	/	/	/	/
	剂量2	4.95	/	0.05	/	/	/	/
	剂量3	4.95	/	0.05	/	/	/	/
	溶剂对照	4.95	/	/	0.05	/	/	/

3）推荐染毒培养体系配制方案

处理方式	组别	培养液体积（mL）	CytoB（mL）	受试物体积（mL）	溶剂体积（mL）	阳性对照体积（mL）
						CP	MMC	秋水仙素
不活化 24h	阳性对照	4.90	0.05	/	/	/	0.05	/
	剂量1	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
	剂量2	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
	剂量3	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
	溶剂对照	4.90	0.05	/	0.05	/	/	/

注：24h染毒的阳性底物需将si裂霉素C稀释5倍后再使用。由于CytoB使用DMSO溶解的，按照食品标准，阴性对照的有机溶剂含量不得超过1%，若受试物需用有机溶剂溶解，样品制剂的有机溶剂含量不得超过70%。

4、收获细胞及制片

用胰蛋白酶溶液消化细胞，加入0.075mol/L氯化-钾溶液进行低渗处理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，可适当调整冰醋酸浓度，但不宜过大）进行固定并滴片，用吉姆萨染液染色，中性树胶封片，并于油镜下进行阅片，每处理组计数500个细胞中的增值指数CBPI和细胞复制指数RI，计算出细胞毒性；每一剂量组应分析不少于2000个核型相差不大的双核细胞，计算微核率。

5、数据分析计算

 

6、结果判定

下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：

1. 受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并与剂量相关；
2. 受试物在任何一个剂量条件下，引起的染色体结构畸变数增加具有统计学意义，并有可重复性。

细胞毒性=1-RI

【注意事项】

实验前请自行准备RPMI 1640培养液、牛血清、细胞培养瓶、0.075mol/L氯化-钾溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、胰蛋白酶、24孔细胞培养板、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、15、50mL离心管等，所有耗材需做无菌处理。

汇智泰康是一家位于中美两地的生物医药合同研发机构，整合中美两地的药物研发技术服务平台，基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025实验室认证，面向企业及研发机构提供分析化学、DMPK、药理药效、生物学、以及毒理安全性评价产品与服务。