动员外周血单个核细胞分离方法和注意事项

正常人外周血中的干/祖细胞的含量占有核细胞数的1%左右，经有效动员后，骨髓中的造血干细胞会释放到外周血中，使外周血中的干/祖细胞比例明显增高。动员外周血是指用有效的动员剂对供者进行动员后采集的外周血。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）是外周血动员最常用的动员剂，它可选择性的作用于粒系造血祖细胞，促进其增殖、分化，并可增加外周血中性粒细胞的数目和功能。动员外周血单个核细胞是采集经动员后的健康供者的外周血，采用密度梯度离心的方法提取其单个核细胞，其各亚型细胞的数量、细胞免疫表型、分泌细胞因子能力和增殖能力等可能会与未动员外周血有一定差异。

1 原理

单个核细胞的体积、形态和比重与其它细胞不同，在沉降过程中不同比重的细胞会处于不同的分布位置。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。

2 方法

1） 取新鲜抗凝动员外周血，按照1：1比例加入1×稀释洗涤液，将血液进行稀释（以降低血液粘稠度），轻柔混匀，备用。

2） 向无菌离心管内加入适量的单个核细胞分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方（分离液：稀释动员外周血=1：2），保持两液面界面清晰。

3） 800g，室温，离心 20min-30min（注：设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档）。

4） 离心结束后，吸弃血浆层，小心吸取PBMC层（即白膜层）并转移至15mL离心管中。离心结束后，管内液面从上至下依次为稀释血浆层、PBMC层、分离液层和红细胞层（见图1）。

图1 稀释动员外周血离心前后的分层状态图

5） 向离心管中加入10mL 重悬细胞，250g，室温离心 10min ，弃上清。重复该步骤 1~2 次，即可用于后续试验。

3 注意事项

1） 血液新鲜程度是影响分离效果的关键因素，请尽量使用采集后24h内的血液进行PBMC分离。

2） 为保证细胞的活力，整个操作过程请轻柔，避免对细胞造成机械性的损伤。

3） 为保持细胞状态良好，请尽量缩短整个试验的周期。

4 动员外周血单个核细胞分离试剂盒

IPHASE/汇智和源针对动员外周血单个核细胞分离的特点，开发了对应的单个核细胞分离试剂盒。该试剂盒包含单个核细胞分离液和洗涤液两个组分，各成分对细胞无毒性，不会影响细胞的原始状态；同时，该试剂盒操作简单便捷，可大大缩短细胞分离时间，分离所得细胞纯度高、状态好、得率高。

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