抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是通过连接子将小分子化合物偶联至靶向性抗体或抗体片段上的一类新型的生物技术药物，可以增强药物的靶向性和稳定性，同时减少临床毒副反应、提高治疗指数，且兼具传统小分子药物的杀伤效应和抗体药物的靶向性，当下主要是应用于抗肿瘤或者其他疾病的靶向治疗的热门药物，是新型的“生物导弹”。
因此，ADC药物一般由单克隆抗体（mAb）、载荷小分子（payload）和连接子（Linker）三部分组成，通过抗体靶向肿瘤细胞表面抗原，将细胞毒素精准高效地递送到肿瘤部位，同时避开正常组织，发挥高其特异性靶向能力和强效的杀伤作用。这复杂的“精准导弹”目标，对ADC药物提出了高稳定性、高利用率的要求，即ADC药物既要在血液循环中维持稳定，又要在到达肿瘤部位精准释放，所以体外研究ADC药物血液稳定性、小分子毒素payload释放及代谢具有重要意义。本篇文章将整体阐述ADC药物体外研究思路并提供“一站式”解决方案。
根据中国国家药监局药审中心（NMPA）发布的关于《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》指示，对ADC药物的研究应从药理学、安全药理学、药代动力学及毒理学等四个方面展开。
一、ADC药物在体外血液基质中稳定性研究的策略
药代动力学药物体外研究的重中之重。作为抗肿瘤药物，ADC药物应在血液循环中保持稳定，避免载荷释放过早导致毒素积累和发生不良反应。NMPA发布的指导原则其明确指出：“临床试验开展前，需在人和动物（药理试验和/或毒理试验动物）的血浆和/或全血等介质中考察ADC的体外稳定性。”因此，采用血液基质在体外评估ADC药物的稳定性是合理且方便的方法。
血浆（Plasma）是血液的重要组成部分，为淡黄色液体，由蛋白质、脂类、无机盐、糖、氨基酸、代谢废物以及大量的水组成，由血液和抗凝剂混合后进一步离心所得，其内不含或含极少血细胞，是ADC体外稳定性评价的最常规基质。常规小分子药物的抗凝剂有EDTA、肝素钠或肝素锂，而ADC药物由于其本身结构的复杂性，常规EDTA抗凝剂为蛋白酶和核酸酶的抑制剂，所以EDTA抗凝剂类血浆不适用于体外ADC药物稳定性考察。
血清（Serum）则是利用促凝管将血液完全凝固离心后的黄色透明液体，其内不含纤维蛋白原，也避免了可能由抗凝剂引起的蛋白结合、酶活抑制和样品稳定性等方面的风险，已逐渐成为ADC药物体外稳定性评价的另一介质。无论是血浆还是血清，为模拟体内稳定性，均应将ADC药物添加在血浆/血清中，于37℃下进行孵育，孵育时常最长不超过21天。由于孵育时间较长，所以应避免在这期间内血液基质出现污染的情况。因此，有部分客户也会选择使用无菌血浆/血清进行验证。最后可检测ADC的变化和/或游离payload的生成。目前捕获ADC药物的一种方法是将ADC中抗体对应的二抗加入到孵育后的溶液中，再结合SA磁珠，即可将ADC药物从孵育液中吸附出来，而后使用LC-MS/MS或其它仪器进行药物分析。
全血(Blood)基质最接近体内真实环境，包含血细胞和血浆所有成分，也是NMPA推荐的体外稳定性验证体系之一。但全血因含血细胞成分，仅能使用新鲜基质进行试验，不适合低温冻存，也不方便运输，且全血在孵育24小时以上伴随着血细胞不断破裂的风险，所以对于需长时间孵育的ADC药物来说，适用性有限。也因此，目前对于ADC药物使用全血进行体外稳定性验证的数据较少。
二、ADC药物的药理/毒理学研究
【ADC药物的药理/药效学研究】
体外药理/药效学研究对ADC的抗体部分要求更高。ADC药物的重要组成是抗体，由Fab端和Fc端组成，Fab端主要发挥抗原结合功能，而Fc端决定抗体的效应功能，包含抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis，ADCP）及补体依赖的细胞毒性作用（Complement Dependent Cytotoxicity，CDC）效应。
ADCC，是指抗体通过Fab段与靶细胞（病毒感染的细胞及肿瘤细胞）表面抗原决定簇特异性结合后，其Fc段可与有FcγR的杀伤细胞【NK细胞（Natural Killer Cell，NK）、单核细胞（Monocytes）、巨噬细胞（Macrophages，m?）、中性粒细胞（Neutrophil）】等效应细胞结合，触发效应细胞的杀伤活性，直接杀伤靶细胞（病毒感染的细胞及肿瘤细胞），这个过程称为ADCC。
与ADCC不同，ADCP也是用于识别和介导治疗性抗体作用于肿瘤细胞的一种重要机制。于ADCP而言，FcγRIIa是该过程的主要FcγR受体，该过程由单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞（Dendritic cells, DC）通过表达FcγRIIa（CD32a）、FcγRI（CD64）和FcγRIIIa（CD16a）来介导来吞噬疾病细胞。
除了上述两种抗体依赖性效应，也需考虑补体系统带来的细胞毒性作用，即CDC效应。补体系统是重要的免疫调节系统，由多种血清蛋白组成的级联酶促反应，其家族成员超过40种蛋白质。其中补体依赖的细胞毒性，指的是补体参与的细胞毒作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物（MAC）对靶细胞发挥裂解效应。
因此，针对ADC药物的研究还需考虑抗体本身带来的效应功能，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，采用自研产品，针对不同效应功能，采用合适的药物进行验证筛选，以便为不同客户提供最佳方案！以ADCC效应为例，发挥效应功能主要依赖于PBMC中的NK细胞或NK细胞本身，而PBMC是较为常规的试验系统选择，因此，合适的PBMC于抗体客户而言至关重要。鉴于此，IPHASE技术人员将PBMC、肿瘤细胞（Raji）与抗体药物利妥昔单抗（RTX）共孵育，同时不含RTX组为对照组。经观察发现，试验组（含RTX）较对照组而言，抗体药物浓度越高，杀死的肿瘤细胞越多，并最终趋于一个最大值。说明此批次PBMC ADCC效应的杀伤率可达30%以上，是客户进行抗肿瘤或抗感染研究的不二选择！
而针对于ADCP和CDC效应，IPHASE也拥有如单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞及提供补体的人和SPF级猴血清等产品，为客户的药理学研究提供多种选择！
【ADC药物抗体部分的毒理学研究】
于复杂的ADC药物而言，抗体部分的毒理学研究也尤为重要。单克隆抗体( (Monoclonal antibody, mAb)类药物通常具有特定的免疫特性，除与适应症相关特定靶部位抗原结合外，若人体正常组织中存在相同或相似的抗原决定簇，还会与靶器官外的组织或细胞结合从而产生严重的不良反应。因此，组织交叉反应(Tissue Cross-Reactivity，TCR)试验应运而生，即在体外检测单抗或相关抗体样生物制品与组织上的抗原决定部位结合的试验，常用检测方法为免疫组织化学技术（Immunocytochemistry, IHC），该试验是抗体类药物I期临床前安全性评价的重要组成部分。为确保抗体类药物的安全性，合理设计的TCR研究设计，规范的试验操作，能够有效控制试验结果的准确性，从而判定抗体类药物是否存在组织交叉反应。TCR试验的结果可帮助确认受试抗体与药效靶组织抗原决定部位的结合，检测抗体是否与非靶部位组织抗原(如组织交叉反应抗原)结合，确定非临床安全性试验相关动物种属，以及预测毒性靶器官。
依据美国FDA的PTC指南和NMPA人用单克隆抗体质量控制技术指导原则中的要求，组织交叉反应（Tissue Cross-Reactivity，TCR）研究所需的组织材料应为手术或者活检的新鲜组织，用恰当的取材、固定及保存方法制备成冰冻切片或石蜡切片。并且，正常人体冰冻组织至少要选择3套来自不同个体的捐献者，而非人灵长类动物及啮齿类动物冰冻组织则至少选择2套来自不同的动物个体。鉴于此，IPHASE以市场为导向，凭借在医药研发领域几十年深耕的经验和完善的产品研发生产平台，现可提供高品质的石蜡包埋组织、OCT包埋组织、冰冻组织及对应处理方式的组织切片等多个品类的正常人体组织、猴组织和其它动物组织的产品，并可提供相应的免疫组化染色产品，为客户的TCR试验提供原材料。以下为FDA要求的32种组织。
注：以上组织除血细胞外本司均可同时提供切片及芯片，血细胞仅可提供切片
三、ADC药物的Linker切割及payload释放
作为靶向抗体和小分子毒素payload的连接子，Linker的重要性不言而喻。根据其在细胞内的水解方式，通常可分为“可切割连接子”和“不可切割连接子”两种形式。
【ADC药物的可切割连接子类型】
可切割连接子被设计为对细胞外和细胞内环境差异（pH、氧化还原电位等）表现出化学不稳定性，或者可以被特定的溶酶体（lysosome）酶切割。化学切割连接子通常包括酸裂解（腙键/碳酸脂）和可还原裂解（二硫键）。前者对体内酸性环境高度敏感，利用内体（endosome,PH 5.5~6.2）和溶酶体（PH 4.5~5.0)的酸性环境触发连接子的断裂，随后释放有效载荷。该类型连接子药物血浆稳定性差、半衰期短，且只能使用中度细胞毒性的payload。如有研究发现，具有腙键的连接子在生理条件下（PH=7.4，37℃）也可以发生缓慢水解，从而导致毒性载荷的缓慢释放，典型的就是曾被召回的“吉妥单抗“药物。作为另一类可还原连接子二硫键则是具有还原型谷胱甘肽依赖性，细胞质中谷胱甘肽水平（1–10 mmol/L）较血浆（～5μmol/L）中更高，因此还原型二硫键连接子在血液循环中相对稳定，在细胞内谷胱甘肽还原裂解二硫键连接子以释放有效载荷。该种方式的连接子切割通常其大部分有效载荷不带有自由巯基，可以与自焚型单元接上自由巯基后，再形成二硫键。
另一种常见的可切割连接子是酶裂解形式连接子。即通过利用细胞中独特的高浓度水解酶来切割并释放药物，包括多肽类（Polypeptide）、葡萄糖苷酶类（Glucosidase）、磷酸酶（Phosphatase）、硫酸酯酶（Sulfatase）及天冬酰胺内肽酶（莱古酶，Legumain）等连接子，其中多肽类连接子是利用细胞内吞作用将ADC药物内化，进而借助肝溶酶体中的组织蛋白酶来选择性地裂解连接子。目前已知组织蛋白酶B（Cathepsin B）可特异性的切割常见的阳性药物德曲妥珠单抗（Enhertu，DS8201）的四肽连接子GGFG和二肽VC连接子。作为酶可连接型连接子，其稳定性较酸裂解及GSH可切割型连接子更稳定，通常与自焚型结构结合使用，是目前较为常见的连接子类型。
由上可知，可切割连接子具有多种类型，因此，选择合适的体系进行切割对于试验的顺利推行具有重要意义！目前常见的payload释放的体外试验系统有酸化肝匀浆液（Liver Homogenate，PH 5.0-6.0）、酸化肝S9（Liver S9 Fraction，PH 5.0-6.0）、肝溶酶体（Liver lysosomes）、肿瘤细胞（Tumor Cells）、纯化的组织蛋白酶B（Cathepsin B）、组织蛋白酶M（Cathepsin M）、组织蛋白酶L（Cathepsin L）、葡萄糖醛酸酶（Glucuronidase）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、天冬酰胺内肽酶（莱古酶，Legumain）等，应针对不同连接子类型选择合适的体系。
IPHASE为助力客户进行payload释放试验，研发并生产了人、猴、犬、大鼠、小鼠等多个种属的酸化肝匀浆液、肝S9、溶酶体及组织蛋白酶B等产品，并进行了相应质控。以食蟹猴肝溶酶体为例，IPHASE使用终浓度1uM的组织蛋白酶B阳性药物Z-RR-AMC进行代谢试验，辅以IPHASE自研溶酶体代谢缓冲液（Catabolic buffer），在PH5.0的环境下使用LC-MS/MS仪器于37℃下分别采集0，30，60，90及120min下Z-RR-AMC的剩余量，其中肝溶酶体的蛋白浓度为0.5mg/ml，发现孵育30min后Z-RR-AMC药物代谢量大于90%，说明IPHASE食蟹猴肝溶酶体中组织蛋白酶B具有高活性！同时，IPHASE也正在开发肝溶酶体及组织蛋白酶B对于阳性药物德曲妥珠单抗（Enhertu，DS8201）的切割体系，以完善对产品的质控标准！
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时间
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底物峰值
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底物剩余量%
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半衰期
T1/2
min
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清除率
uL/mg/min
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0min
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108993.00
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100
|
9.02
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153.60
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30min
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10785.00
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10.00
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60min
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1227.00
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1.00
|
【ADC药物的不可切割连接子】
继了解了可切割连接子类型后，还有一种是不可切割连接子。不可切割连接子依赖于细胞质和溶酶体蛋白酶对ADC抗体成分的完全降解，并最终释放与降解抗体衍生的氨基酸残基连接的有效载荷分子，包括硫醚和马来酰亚氨基己酰基（MC）两类，它们由稳定的键组成，防止蛋白水解裂解，并确保比其可裂解的对应物更大的稳定性。因此，不可切割连接子提高了血浆内的稳定性，且降低了脱靶毒性，但其也需要肿瘤细胞高表达抗原，且偶联药物要有强的内化能力。因此，对于不可切割连接子而言，使用酸化肝匀浆液、肝S9及溶酶体等产品便于较好地降解抗体部分并释放payload。
下表为目前已公布的ADC药物种类及其对应的连接子和小分子毒素类型。
四、ADC药物的payload研究
继了解ADC药物连接子类型后，研究另一个ADC药物的重要组成——有效载荷（payload）至关重要！有效载荷的活性和理化性质直接影响着ADC药物的抗肿瘤疗效。有效载荷的作用机制是决定ADC性能的一个重要因素。此外，ADC有效载荷的其他特性，如细胞毒性、免疫原性、制备和循环过程中的稳定性、水溶性和可修饰性也很重要。一般理想的有效载荷需具备以下几点优势：
目前，常用的细胞毒性药物效应分子为微管抑制剂（如：auristatins、maytansinoids）、DNA损伤剂（如calicheamicin、duocarmycins、anthracyclines、pyrrolobenzodiazepine dimers）和DNA转录抑制剂（Amatoxin和Quinolinealkaloid (SN-38)）。
无论是哪种连接方式断裂下的有效载荷，都需按照小分子药物对其ADME及药物相互作用进行深入分析，尤其是全新或带有部分抗体片段或部分连接子的小分子，应按照新化合物对其进行研究分析，深入了解其吸收、分布、代谢和排泄的过程，以防未知的代谢对组织产生额外的毒性作用。因此，对有效载荷的研究常通过全血（Blood）、血浆（Plasma）、肝匀浆液(Liver Homogenate)、肝细胞（Hepatocytes）、肝S9（Liver S9 Fraction）、肝微粒体(Liver Microsomes)及CYP重组酶（CYP Recombinase）和UGT重组酶（UGT Recombinase）等产品研究其药物本身及代谢产物的生成，同时也需要确定其与转运体的关系。除此以外，作为全新的化合物，对其进行毒理学的研究也是非常必要的，即应对该化合物进行体外遗传毒理试验，包含但不限于细菌回复突变（Bacterial Reverse Mutation Test，即Ames Test）、使用小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）的TK基因突变（TK Gene Mutation Test）和HPRT（HGPRT）基因突变（HPPRT Gene Mutation Test）及使用中国仓鼠肺细胞（CHL）进行试验的体外染色体畸变（In Vitro Chromosome Aberration Test，即CA Test）等，便于更加全面地了解该化合物的毒性影响！
鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，不担拥有人、猴、犬、大鼠、小鼠等多种属多类别的自研产品，且对每种产品质量进行严格把控，为客户提供最佳的使用感。以血浆产品为例，IPHASE为更好地服务客户，将血浆产品分为普通血浆、PPB专用血浆、血浆稳定性试验专用血浆及PPB和稳定性均经验证过的血浆，不同适用性产品使用不同小分子阳性药物进行验证。其中，PPB专用血浆使用终浓度为5uM的华法林，使用IPHASE自研平衡透析装置或快速平衡透析装置，验证不同种属下血浆的PPB结合率，将满足要求的批次分别记录，根据客户需求进行售卖，减少了客户的验证时间和试验误差，大大缩减了客户试验周期。以下为IPHASE技术人员使用快速平衡透析装置以SD大鼠血浆进行的PPB试验，使用华法林为阳性药物，在37℃、5% CO2培养箱中振荡孵育6小时。其中，Rat-6h-PBS是阴性对照组，Rat-6h是试验组，结果显示其血浆蛋白结合率高于99%，满足大鼠血浆蛋白结合率≥98%的要求。
综上所述，作为具有精准靶向性、减少等正常细胞损害及可克服耐药性的新型肿瘤治疗药物ADC，已逐步成为肿瘤治疗领域的热门方向之一。因此，完整的非临床研究对其至关重要，以下为IPHASE/汇智和源可为广大ADC药研发客户提供的完整体外非临床研究“一站式”解决方案产品，以期同广大客户一起，更好的为新药研发贡献力量！
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方向
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种属
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英文名称
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中文名称
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规格
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ADC稳定性
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人、猴、犬、大鼠、小鼠
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Fresh Blood
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新鲜全血
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5/50/100 mL
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Plasma
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血浆
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5/10/50/100 mL
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Serum
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血清
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5/50/100 mL
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抗体
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Peripheral blood mononuclear cell,PBMC
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外周血单个核细胞
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5/10 million
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CD14+ Monocytes
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CD14+单核细胞
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2/5 million
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CD56+ NK Natural Killer Cells，NK
Cells
|
CD56+NK细胞
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2/5 million
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Dendritic Cells，DC Cells
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DC细胞
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1.5 million
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Macrophages, m?
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巨噬细胞
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1.5 million
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人、猴
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TCR Test Frozen Tissue
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TCR冰冻组织
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≈1 cm3
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TCR Paraffin Embedded Tissue
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TCR石蜡包埋组织
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盒
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TCR OCT Embedding Tissue
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TCR OCT包埋组织
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盒
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Linker
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人、猴、犬、大鼠、小鼠
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Liver Homogenate (pH 6.0)
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酸化肝匀浆液
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10mL,0.2g/mL
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Liver S9 Fraction
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人、猴、犬、大鼠、小鼠 肝S9
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0.5mL,20mg/mL
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Lysosome
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溶酶体
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250μL,2mg/ml
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Tritosome
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毛状体
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250μL,2mg/ml
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Catabolic buffer
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溶酶体代谢缓冲液
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A液1mL，B液10μL
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Catabolic buffer Ⅰ
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溶酶体代谢缓冲液I
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A液1mL，B液10μL
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Catabolic buffer Ⅱ
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溶酶体代谢缓冲液II
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1mL
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Cathepsin B
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组织蛋白酶B
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10/50 μg
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DS8201/DS8201a
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德曲妥珠单抗
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50/200 uL,2mg/mL
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Z-RR-AMC
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Z-精氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐
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50/200 uL,2mg/mL
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Payload
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Suspension Primary Hepatocytes
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悬浮原代肝细胞
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2/5 million
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Plateable Primary Hepatocytes
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贴壁原代肝细胞
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2/5 million
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Liver Homogenate
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肝匀浆液
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10mL,0.2g/mL
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Liver S9 Fraction
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肝S9
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0.5mL,20mg/mL
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Liver Microsomes
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肝微粒体
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0.5mL,20mg/mL
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/
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NADPH Regeneration System
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NADPH再生系统
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A液5mL,B液1mL
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UGT Incubation System
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UGT孵育系统
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3mL
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人、猴、犬、大鼠、小鼠
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PPB Plasma
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PPB血浆
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5mL
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Plasma Stability
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稳定性血浆
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5mL
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/
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PPB Dialysis
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平衡透析装置
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24/48/96孔
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Dialysis Membrane
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平衡透析膜
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3.5/12-14/25/50Kda
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Rapid Equilibrium Dialysis Device
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快速平衡透析装置
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48插件
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Rapid Equilibrium Dialysis Inserts
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快速平衡透析装置配套插件
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10/50个；8/12-14Kda
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人
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Human CYP reductase
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人CYP重组酶
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0.5mL,0.5nmoL
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Human UGT reductase
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人重组UGT酶
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0.5mL,5mg/mL
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Human SLC Transporter
Cells
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MOCK/HEK293F、
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8-10million
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人OCT2 SLC转运体细胞
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8-10million
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人MATE1 SLC转运体细胞
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8-10million
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人MATE2-K SLC转运体细胞
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8-10million
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人OAT1 SLC转运体细胞
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8-10million
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人OAT3 SLC转运体细胞
|
8-10million
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人OATP1B1 SLC转运体细胞
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8-10million
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人OATP1B3 SLC转运体细胞
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8-10million
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Human ABC Vesicles
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人MDR1(P-gp)转运体囊泡
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0.5mL 5mg/mL
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人BCRP转运体囊泡
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0.5mL 5mg/mL
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空载囊泡
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0.5mL 5mg/mL
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/
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Ames Test Kit
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遗传毒性Ames试剂盒
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单菌/两菌/四菌/五菌版
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In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test
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TK基因突变试剂盒
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20mL*36 test
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In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test
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HGPRT基因突变试剂盒
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In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Kit
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体外染色体畸变试剂盒
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5mL*30 test
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In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test
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体外微核试验试剂盒
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5mL*32 test
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Comet Assay Kit
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彗星试验试剂盒
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20/50 test
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金黄地鼠
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Hamster(LVG) Liver S9,Induction
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诱导金黄地鼠肝S9
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雄性35mg/mL，1 mL
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大鼠
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Rat(Sprague-Dawley) Liver S9,Induction
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诱导混合SD大鼠肝S9
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雄性35mg/mL，1/2/5 mL
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Activation System Rat Liver S9 Mix
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大鼠肝S9活化系统
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10 mL
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人、猴、犬、大鼠、小鼠
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Blank Biological Matrix
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尿液
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1/2//5/10 mL
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粪便
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5/100 g
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胆汁
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1/2//5/10 mL
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