体内碱性彗星试验方法及导则

体内碱性彗星方法及导则

体内碱性彗星试验在化合物遗传毒性评价中的应用日益广泛。ICH S2(R1)已将肝脏彗星试验列为第2个组织/终点的体内试验；体内哺乳动物碱性彗星试验的指导原则（TG489）也已颁布。体内碱性彗星实验能够检测DNA链断裂、碱性不稳定位点、不完整切除修复引起的DNA链的断裂等任何感兴趣，能够制成合适细胞悬液的组织DNA损伤。与其他试验相比其检测的是单细胞水平的DNA损伤，因此该试验敏感性较高，操作简单，经济省时。

实验原理

彗星实验（comet assay）也称单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一种有效评估DNA损伤的方法。其原理是器官或组织经处理（如辐射、重金属等）后，细胞中的DNA发生单链或双链断裂，经细胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在电场作用下，DNA 断片迁移出细胞核，形成彗星状的电泳图谱。正常细胞的大分子DNA在电场作用下迁移距离较短，DNA仍保留在细胞核的范围，形成圆形或轻微拖尾的图谱。根据电泳缓冲液的pH值不同，可分为中性彗星实验（pH=8.4）和碱性彗星实验（pH＞13）。中性彗星实验主要用于检测DNA双链的断裂损伤，碱性彗星实验具有更高的灵敏性，可用于检测更少量的单链和双链断裂损伤。

需要注意的是，试验过程中的个方面，包括样品准备、电泳条件、视觉分析参数(如染色强度、显微镜光强度以及使用显微镜滤镜和相机动态和环境条件(如背景照明)已经被研究，可能影响DNA迁移。

碱性彗星指导原则

TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals

试验能力验证

每个实验室都应证明能够为所使用的目标组织获得足够质量的单细胞或细胞悬浮液，从而在彗星试验中建立实验能力，北京汇智泰康医药技术有限公司可提供专业毒理学服务。首先通过%尾DNA的评价，对照处理组动物%尾DNA在低范围内。目前的数据表明,尾部DNA百分比(基于平均中位数)在大鼠肝脏应该最好不要超过6%,这将是符合JaCVAM验证试验的值和其他出版和私有数据。目前还没有足够的数据对其他组织的最佳或可接受范围提出建议。这并不排除合理使用其他组织。测试报告应根据已发表的文献或专有数据，对彗星试验在这些组织中的性能进行适当的审查。首先，在对照组中，需要一个较低的%尾DNA范围，以提供足够的动态范围来检测阳性的影响。其次，每个实验室都应能够按照表1所建议的不同方式，对直接诱变剂和促进剂的反应。

表一：阳性对照物质及其部分靶组织

应收集阴性对照数据，以证明阴性数据反应的再现性，并确保对检测的技术方面进行适当控制，或建议需要重新建立历史控制范围。

历史对照

在实验室能力验证过程中，实验室应建立历史数据库，建立相关组织和物种的阳性和阴性对照范围和分布。不同的组织和不同的物种，以及不同的给药溶媒和给药途径，可能会产生不同的%尾DNA阴性对照值。因此，建立每个组织和物种的阴性对照范围是很重要的。实验室应采用质量控制方法，以确定其数据的变化程度，并表明该方法在其实验室中得到了“控制”。可能还需要优化选择适当的阳性对照物质、剂量范围和实验条件(例如电泳条件)，以便发现微弱的影响。

对实验方案的任何更改都应根据其与实验室现有历史控制数据库的一致性加以考虑。任何重大的不一致都应导致建立新的历史控制数据库。

方法描述

动物选择：通常使用健康成年啮齿动物(6-10周龄，但年龄稍大的动物也可接受)。

动物准备：动物随机分为对照组和实验组。在开始实验前，这些动物适应实验室条件至少5天，给予标识识别。试验开始时,动物的重量差异应该不超过±20%。

样品制备：在给动物给药前，固体测试化学品应溶解或悬浮在适当的溶媒中，或混合在饮食或饮用水中。液体试验化学品可直接加药或在加药前稀释。对于吸入暴露，根据其物理化学性质，试验化学品可以作为气体、蒸汽或固体/液体气溶胶使用。

溶媒：在使用的剂量范围内，溶媒不应产生毒性作用，也不应与试验物质发生化学反应。如果使用的不是常用溶媒应提供参考数据，说明它们在测试动物、管理路线和终点方面的兼容性。建议在可能的情况下，应首先考虑使用水性溶剂/溶媒。值得注意的是，一些溶剂可诱导炎症反应，增加接触部位DNA链断裂的背景水平，尤其是与多药给药时。

阴性对照：阴性对照动物，单独用溶媒处理，其他处理方法与治疗组相同，每一次采样时间和组织的每次检测均纳入一组阴性对照动物。阴性对照动物的尾部DNA应在每个组织预先设定的实验室背景范围和该物种的取样时间内。

动物数量和性别：目标是每组提供至少5只可分析的单性别动物，或如果使用两种动物，则每组至少提供5只可分析的单性别动物。如果人类接触到的化学物质可能具有性别特异性，例如某些药物，则应在适当的性别下进行检测。三个剂量组和同时进行的阴性和阳性对照(每一组由5只单性别动物组成)，将需要25至35只动物。

试验计划：动物应接受为期2天或以上的每日给药(即每隔约24小时进行两次或两次以上)，并在最后一次治疗后的2-6小时采集一次样本。延长剂量方案(如28天每日给药)的样本是可以接受的。测试化学品也可以分次使用，即，两组给药在同一天间隔不超过2-3小时，便于给药量大。在这种情况下，取样时间应根据最后一次给药的时间来安排。

剂量水平：对无毒试验化学品，给药14天以上的，最大(限)剂量为1000mg /kg体重/天。给药时间少于14天，最高剂量为2000毫克/公斤体重/天。

采样时间：采样时间是一个关键变量，因为它是由测试化学物质在目标组织中达到最大浓度所需的时间和DNA链断裂的诱导时间决定的，但在这些断裂被移除、修复或导致细胞死亡之前。

组织收集：因为它可以研究诱导的DNA链断裂(彗星)在任何组织中,组织选择应清晰、基于收集的原因进行研究与任何现有的基因毒性、致癌性或其他测试物质的毒性数据在调查之中。应考虑的重要因素应包括给药途径、预测的组织分布和吸收、代谢的作用以及试验物质可能的作用机制。肝脏是研究最频繁、数据最丰富的组织。因此，在缺乏任何背景信息的情况下，如果没有确定感兴趣的特定组织，那么对肝脏进行取样是合理的，因为肝脏是异种生物代谢的主要场所，而且常常高度暴露于母体物质和代谢物中。在某些情况下，直接接触部位的检查(例如，口服药物，胃腺或十二指肠/空肠，或吸入药物，肺)可能是最相关的。应根据进行测试的具体原因选择其他或替代组织，但如果实验室已证明对这些组织的熟练程度和同时处理多个组织的能力，对同一动物的多个组织进行检查可能是有用的。

样本制备：在最后一次用测试化学品后的适当时间，对动物实施安乐死。收集选定的组织,而同时采集同一组织的一部分,放置在甲醛溶液或适当的固定剂可能组织病理学分析。彗星实验的组织被放置在切碎缓冲液中，用冷切碎缓冲液充分冲洗以去除残留的血液，并储存在冰冷的切碎缓冲液中，直到处理完毕。原位灌注也可进行，如肝、肾灌注。

玻片准备：单细胞悬液制备后，应尽快(最好在1小时内)制备载玻片，但动物死亡与载玻片制备之间的温度和时间应严格控制，并在实验室条件下进行验证。向低熔点琼脂糖(通常0.5-1.0%)中加入细胞悬浮液的体积，使玻片的低熔点琼脂糖百分比不应降低到0.45%以下。最佳的细胞密度将由用来给彗星评分的图像分析系统决定。

细胞裂解：裂解条件也是一个关键变量，可能会干扰特定类型的DNA修饰(某些DNA烷基化和碱基内收)导致的链断裂。因此，我们建议在实验中对所有玻片的裂解条件尽可能保持恒定。准备好后，应在约2-8摄氏度的弱光条件下(如黄光(或防光)，将载玻片浸入冷冻溶解液中至少1小时(或过夜)，以避免暴露在可能含有紫外线成分的白光下。在此潜伏期之后，在碱液展开步骤之前，应冲洗载玻片以除去残留的洗涤剂和盐。这可以用纯净水、中和缓冲液或磷酸盐缓冲液来完成。也可以使用电泳缓冲液。这将维持电泳室的碱性条件。

解旋和电泳：将载玻片随机放置在含有足够电泳溶液的潜电泳装置的平台上，使载玻片表面完全覆盖(每次覆盖的深度也应一致)。在其他类型的彗星试验电泳装置，即主动冷却，循环和高容量电源，较高的解决方案覆盖将导致更高的电流，而电压保持不变。

测量方法：彗星应该使用自动化或半自动化的图像分析系统进行定量评分。用合适的荧光染色剂对载玻片进行染色，并在配备有超荧光和适当检测器的显微镜或数码相机上进行适当放大(如200x)的测量。

根据彗星图像图谱的描述，细胞可以分为三种类型，即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的细胞(明确定义的头部和尾部，不干扰相邻的细胞)应该为%的尾部DNA，以避免人为干扰。刺猬的频率应该根据每个样本至少150个细胞的视觉评分(因为缺少一个清晰定义的头部意味着它们不容易被图像分析检测到)来确定，并单独记录下来。

所有用于分析的玻片，包括阳性和阴性对照的玻片，都应独立编码并进行“盲法”评分，以便评分者不知道情况。对于每个样本(每个动物的每个组织)，至少应该分析150个细胞(刺猬除外)。分析150细胞/动物至少5动物每剂，提供足够的统计能力。

彗星DNA链断裂可以通过尾DNA %、尾长和尾力矩等独立端点来测量。如果使用适当的图像软件分析仪系统，就可以进行这三种测量。然而，推荐将%尾DNA(也称为%尾强度)用于结果的评估和解释，并由以细胞总强度百分比表示的尾DNA片段强度决定。

数据处理和结果判断

在实验条件下，阳性对照组的尾DNA%的与阴性对照相比具有统计学意义上的增加（p<0.05）时，判定试验系统有效。

在试验系统判定有效的前提下，同时满足以下三个条件，则判定受试样品为阳性结果：

（1） 尾DNA%的在某个单独剂量组显著升高；

（2） 尾DNA%随试验样品浓度升高有显著增加趋势；

（3） 受试物组的尾DNA%全部超过阴性背景数据范围。

在判定阳性结果时，如仅符合上述标准中的一个或两个，除统计学意义外，还应考虑其生物学意义。

如全部不符合上述3个，则判定为阴性结果。

彗星试验试剂盒

北京汇智泰康医药技术有限公司针对碱性彗星试验开发试剂盒，本试剂盒省去了试验溶剂配制、溶胶配制不稳定等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，符合碱性彗星试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。碱性彗星试剂盒应用广泛，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。

【产品说明】

    本试剂盒提供了单细胞凝胶电泳试验需要的试剂和耗材。

试剂名称 规格 数量 储存条件

1. 细胞裂解液避免了多成分配制的繁琐工艺，保证了每次实验细胞裂解的稳定性。

2. 电泳胶经过采用先进工艺规模化制备，出厂前经过严格的质量检测，实验时直接溶解即可使用。

3. 针对实验设计的两孔式玻片增加了溶胶的粘附性，使细胞完整，便于拍照分析。

【试剂盒应用范围】

本试剂盒应用范围非常广，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装 材料等遗传毒理学检测。

【传统试验操作不足】

1. 溶液配制繁琐，每次配制裂解效果不同。

2. 不同胶浓度会影响DNA尾百分数，过低浓度的胶稳定性差，过高浓度的胶会抑制彗星尾的产生，且反复溶胶会导致储备液蒸发，影响试验结果。

3. 传统玻片对溶胶的粘附性较低，且溶胶易流出玻片，损失较大。

【试剂盒优势】

便捷——汇智泰康彗星试验试剂盒省去了裂解液配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。

准确——汇智泰康彗星试验试剂盒各成分均经过严格质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。

稳定——汇智泰康彗星试验试剂盒稳定性强、易于运输和保存。