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平衡透析法检测血浆蛋白结合率原理及注意事项

平衡透析法检测血浆蛋白结合率原理及注意事项
药物血浆蛋白结合率(Plasma Protein Binding, PPB)即血液中与蛋白结合的药物占总药量的百分数,可以反映药物与血浆蛋白结合的程度。药物血浆蛋白结合率是药物在动物体内重要的药理学参数之一,影响着药物体内游离浓度进而影响药物的分布与排泄。药物在进入血液后与血浆蛋白会有不同程度结合,血液中游离药物的比例会影响其在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程,与血浆蛋白结合的药物可能会有更长的半衰期和更慢的清除速率,因此测定血浆蛋白结合率对于理解化合物的活性以及组织分布有很重要的参考意义。
1 结合蛋白类型
血浆蛋白主要作为载体负责各类外源性和内源性分子在循环系统内的转运。其中参与小分子药物结合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白(AAG)、球蛋白和脂蛋白,主要以白蛋白和α-1-酸性糖蛋白(AAG)为主。药物与蛋白的结合强弱主要与药物-蛋白亲和力、蛋白丰度相关。
2 血浆蛋白结合率常用测定方法
目前常用于药物血浆蛋白结合率测定的常用方法包括平衡透析法(Equilibrium Dialysis),超滤法(Utrafiltration Method),超速离心法(Ultracentrifugation Method),凝胶过滤法(Gel filtration)等。 其中,平衡透析法是基于药物结合的平衡原理来测定药物游离浓度最常用的方法,也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。超滤法使用滤膜分立自由的药物和结合蛋白的药物,时间短,但确定点是药物容易结合到超滤过程使用的器械上,从而影响检测结果。平衡透析法虽然比超滤法耗时多一些,但它使用teflon镀层的平衡装置,能大大减少药物的非特异性结合,得到更精确的结果。目前,平衡透析法已有96孔板的高通量测试形式,可以实现同时测试大量候选药物的蛋白结合率。
平衡透析法
常用种属血浆:大鼠血浆,小鼠血浆,比格犬血浆,猴血浆,人血浆
分析方法:HPLC,LC-MS/MS,GC-MS等
各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合之后,在血浆中会同时存在结合型与游离型两种类型,游离性药物具有药物活性。药物与血浆蛋白结合会成为结合型药物,暂时失去药理活性,并且储存于血液中,起到药库的作用,对于药物作用及其维持时间长短具有重要的意义。一般蛋白结合率高的药物体内消除慢,作用维持时间长,药效平稳。结合率低的药物体内消除快,同时作用时间短,药效有很大的波动。
平衡透析法测定血浆蛋白结合率是用透析膜将蛋白质溶液与缓冲液分隔开,建立在两者之间的一种平衡状态,只有分子量小的药物小分子可以通过。透析的动力是扩散压,扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度与膜的厚度、透析的小分子溶质在膜两边的浓度梯度及透析温度等因素有关。平衡透析法能够直接测出为与蛋白结合的药物小分子的数量,这是分析蛋白与小分子物质结合的关键,从而能够求出结合位点数及结合常数。

图1:分隔示意图
如图所示,利用透析膜将左右两室进行分隔,膜左侧加入含药的待测药物,膜右侧加入空白缓冲液,未被结合的游离药物可以自由穿过透析膜,孵育一定时间后两侧达到平衡,游离药物浓度相等,通过HPLC、LC-MS/MS或者GC-MS等方法测定两侧药物浓度,利用公式即可计算得到血浆蛋白结合率。这种透析膜只允许特定分子量的小分子通过,而阻止蛋白大分子通过。

平衡透析法在测定药物血浆蛋白结合率具有操作简单、温度易于控制、PH值可调、设备成本低廉等优点。但是同时存在达成平衡时间较长、溶液体积会变化,且透析时间过长可能会造成由加热或代谢引起的被测物质的降解等缺点。因此在利用平衡透析法测定药物血浆蛋白结合率,或者药物与蛋白质相互作用时需要与其他的一些方法联用,才能获得更准确的作用信息。一般只有血浆蛋白结合率高,分布容积小,消除慢以及治疗指数低的药物在临床上的这种相互作用才有意义。
汇智泰康ADME服务项目
血浆蛋白结合率测定
代谢稳定性研究
肝微粒体代谢实验
肝细胞代谢稳定性试验
代谢表型研究
代谢产物鉴定
代谢途径鉴定
种属比较研究
细胞色素P450抑制实验(CYP450抑制试验,常用CYP450酶包括CYP1A2,CYP2A6,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4等)
细胞色素P450诱导实验(CYP450诱导试验)
血浆稳定性试验
跨膜转运试验
药物-药物相互作用
毒理学研究
4 血浆蛋白结合试验检测试剂盒
汇智泰康针对血浆蛋白结合率测定试验研发针对性的平衡透析装置,平衡透析装置包括96个透析池和透析池之间的透析膜组成,可以同时对多个样品进行透析测定,确定游离化合物比例。透析膜(半透膜)选用高分子膜,孔径可根据客户需求定制。
产品:
血浆蛋白结合平衡透析装置
血浆蛋白结合试剂盒
血浆蛋白结合试剂盒-猴血浆
血浆蛋白结合试剂盒-比格犬血浆
血浆蛋白结合试剂盒-大鼠血浆
血浆蛋白结合试剂盒-小鼠血浆
试剂盒组分:
①透析膜
②不同种属血浆
③PBS缓冲液
注意事项:
①影响血浆蛋白结合率测定的因素很多,如溶解度、温度、非特异性结合、酯酶代谢等,需要根据化合物特征,结合研究目的选择合适的测定方法进行实验。
②如果有的药物具有很高的蛋白结合能力,试验条件的微小偏差可能会使试验结果出现较大偏差,从而大大提高血液中药物的浓度而引起毒性。

图2:平衡透析系统

图3:半透膜
汇智泰康是一家位于中美两地的生物医药合同研发机构,整合中美两地的药物研发技术服务平台,基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025实验室认证,面向全球企业及研发机构提供分析化学、DMPK、药理药效、生物学、以及毒理安全性评价产品与服务。体外研究内容包括血浆蛋白结合率,肝微粒体代谢稳定性,肝细胞代谢稳定性,CYP450代谢表型鉴定,CYP450酶抑制与酶诱导,代谢产物推断与鉴定等。

 

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