TK基因突变试验
TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。TK基因突变属于常染色体基因突变。TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。

TK基因突变试剂盒
北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。

便捷—— 本试剂盒省去了诱导 S9 制备，阳性底物、筛选培养基的配制和浓度条件摸索的时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。
准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合L5178Y细胞基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。

【试验原理】
TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。在细胞培养物中加入三氟胸苷（TFT），则TFT在胸苷激酶的催化下生成三氟胸苷酸，进而参入DNA，造成致死性突变，细胞不能存活；若TK基因发生突变，导致细胞胸苷激酶（TK）缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺入DNA，突变细胞表现出对TFT抗性，在TFT存在条件下仍能生长。在有或无代谢活化的条件下，将细胞培养物暴露于受试物适当时间，经适当的培养时间，计数集落，计算突变频率，从而推断受试物致突变性。
【产品说明】
本试剂盒提供进行体外哺乳动物细胞TK基因突变试验所需的主要试剂和细胞，可用于评价受试物的致突变作用。其中所用细胞和试剂均符合国标要求，且在国标的基础上引入了MTT染色法，使的结果观察更为直观，为实验结果的可靠性提供了支持。

产品组分	规格	数量	使用说明	保存条件
细胞（L5178Y）	1mL	1	/	-70℃
THMG（100×）	0.5mL	1	使用前混匀
THG（100×）	0.5mL	1	使用前混匀
S9复合物	5.0mL	1	冰浴融化并混匀
环磷酰胺（CP）	0.5mL	1	800 μg/mL，使用前混匀
三氟胸苷（1000）	2mL	1	3 mg/mL，使用前混匀
磷酸盐缓冲液	60mL	1	使用前混匀	室温
加基皇酸甲酯（MMS）	0.5mL	1	1.5 mg/mL，使用前混匀
染色剂MTT	70mL	2	1 mg/mL，使用时 10μL/孔加入96孔板中

【产品使用说明】
1、细胞复苏
从-70冰箱取出细胞，于37℃水浴融化，1000rpm离心5min，弃上清，用含10%马血清、0.2mg/mL一同酸钠的RPMI 1640培养液（RPMI-10）中重悬细胞；1000rpm再次离心5min，弃上清，用RPMI-10重悬后接种于细胞瓶中培养。
2、自发突变细胞清除
取对数生长期细胞悬液，于含1% 的THMG（100×）的完全培养基中培养24 h，1000 r/min离心5 min，洗涤后于含1%的THG（100×）完全培养基中继续培养2 d。
注：为确保试验的可行性，试验中所用细胞的自发突变率应在5010-6~20010-6之间，清除自发突变的细胞传代使用不得超过1个月，每次试验前需将细胞清除自发突变。
3、染毒处理
取生长良好的细胞，调整细胞密度为5×105个/mL（细胞数可根据实验室情况做调整），在加或不加代谢活化系统的条件下，按1%的体积加入不同浓度的受试物，37℃，70 rpm/min染毒处理3h，每个试验组平行处理两份培养物。
（1）S9混合液及染毒用细胞液配制

注：在试验过程中，需根据实际需求，调整配制量。
（2）推荐染毒培养体系配制方案（以4个受试物剂量组为例）

注：染毒时间可根据实际情况进行调整，一般为3h~6h，必要时可延长到1个或多个细胞周期。若需进行24小时染毒，所用阳性底物需稀释3倍后再加入。
4、表达培养
染毒细胞经离心洗涤后，重悬细于RPMI-10培养液中，于在细胞培养瓶中表达培养2 d。每天测定细胞密度，计算悬浮生长（SG）、相对悬浮生长（RSG）和细胞相对总生长（RTG），具体方法可参照国标方法要求。
5、突变频率测定
表达培养2天后，用含20%马血清、0.2mg/mL内容酸钠的RPMI 1640培养液（RPMI-20）重悬细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，加入TFT（终浓度3 μg/mL），混匀，0.2mL/孔接种96孔板（即2000个细胞/孔），于37℃、5% 二氧化碳的培养箱中培养12 d，10μL/孔加入MTT染色剂，继续于培养箱中放置2~4h，计数每块平板有大集落LC和小集落SC生长的孔数。试验样品处理组和阳性对照组每份培养物各设2个重复；阴性溶媒对照组设4个重复。
6、数据处理和结果评价
数据处理方法和结果判定可参照：476 体外哺乳动物细胞基因突变试验，化学品测试方法健康效应卷（*版），中国环境出版社，2013年（ISBN：978-7-5111-1476-1）；OECD 490等。
注：在染毒处理和表达培养结束后，均需对平板接种效率进行测定，且要保证PE在70%~130之间，具体可参照国标方法进行。
【注意事项】
1.实验前请自行准备RPMI 1640培养液、马血清、冰统酸钠、细胞培养瓶、96孔细胞培养板、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、50mL离心管等，所有耗材需做无菌处理。
2.实验操作应在符合细胞培养实验要求的环境下进行。
3.细胞清除自发的突变使用的血清*与正式试验血清同一厂家同一批号。
4.实验过程中注意细胞计数的准确性。


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