从复苏到维持｜一站式肝细胞 3D 成球解决方案

近年来，全球药物研发与生命科学研究迎来关键变革。2025年美国FDA正式官宣政策革新，逐步取消单抗药物安全性评估的强制动物实验要求，全力鼓励类器官（Organoid）、3D细胞球状体（3D Spheroid Culture）等非动物替代模型（NAMs）的临床前应用。这一政策落地，让长期受限于2D培养缺陷的肝脏研究迎来破局契机。肝脏作为人体核心代谢、解毒器官，其生理功能高度依赖复杂的三维空间结构与细胞交互作用。传统2D单层肝细胞培养模式，强行将细胞平铺于培养基底，彻底破坏体内天然微环境，导致肝细胞快速去分化、CYP450代谢酶活性骤降、白蛋白分泌功能丢失。

原代肝细胞3D成球（3D Spheroid Culture）培养技术，通过细胞自组装形成立体球状体，高度模拟肝脏体内三维结构、细胞交互与代谢特征，有效解决2D模型预测偏差大、功能维持短的痛点，成为肝脏疾病机制研究、药物肝毒性筛查、再生医学研究的黄金模型。但不少科研团队在实操中面临难题：成球不均、球体易散、功能维持时间短、批次差异大、培养基适配性差……优质3D肝球模型的构建，绝非简单的细胞堆叠，而是培养耗材+专属培养基+标准化流程的系统化协同。

IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，可为大家提供全套肝细胞3D成球专属解决方案，以U底超低吸附培养板（Ultra-Low Attachment U-Bottom Culture Plate）、专用细胞复苏培养基（General Hepatocyte Thaw Medium）、3D成球培养基（Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium）、3D维持培养基（Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium）四大核心产品为支撑，搭配标准化操作流程，轻松构建形态均一、功能稳定、生理相关性高的3D肝球模型，全方位适配多场景科研需求。

01    肝脏体外研究的前沿利器：肝细胞3D成球培养及应用
球状体培养是一种初代三维细胞培养（3D Cultivation，3D培养）技术，是由原代细胞或癌细胞系在培养过程中自组装成简单的球形或多细胞聚集体，保留了三维结构和组织特异性。球状体培养相对简单，通过超低粘附培养、悬滴培养、磁化细胞培养等技术，原代细胞可以不依赖细胞外基质Extracellular Matrix（ECM），仅通过相互作用自然聚集形成直径高达150-175μm的球状团聚体。与传统的二维单层细胞培养相比，球状体培养能够更真实地反映细胞在体内的生理特性，适合肿瘤生物学研究和高通量药物筛选分析。

肝脏作为人体最大的代谢器官，其功能实现高度依赖肝细胞与周围细胞、细胞外基质形成的复杂空间网络。传统2D培养将肝细胞平铺于培养皿，破坏了这种天然交互关系，导致肝细胞在培养5天内就会发生去分化，丧失CYP450代谢酶活性、白蛋白分泌等核心功能，无法真实反映体内药物代谢与毒性反应规律。

相比之下，肝细胞3D成球培养（3D spheroid culture）通过细胞自聚集形成立体结构，高度模拟了体内肝脏的微环境特征，展现出三大不可替代的优势：
（一）首先，功能维持更持久。3D肝球中的肝细胞通过细胞-细胞、细胞-基质间的紧密作用，可将核心功能维持21天以上，部分HepaRG细胞系形成的球体存活甚至超80天，远超2D培养的功能周期，为长期药物暴露、疾病进展等研究提供了可能。
（二）其次，生理相关性更高。肝球内部形成的缺氧梯度、窦状样结构，能精准模拟体内肝脏的生理微环境，使肝细胞的白蛋白分泌、胆汁生成、药物代谢等功能更贴近体内真实状态，显著提升药物毒性预测的准确性。
（三）最后，应用场景更广泛。无论是药物肝毒性筛查、病毒性肝炎机制研究，还是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化等病理模型构建，3D肝球都能提供更可靠的实验数据，解决2D模型预测偏差大的痛点。

凭借高生理相关性优势，3D肝球模型已在多个研究领域实现突破，成为科研与产业转化的核心工具。
(1) 在药物研发领域，3D肝球大幅提升了药物肝毒性预测的准确性。传统2D模型因功能丢失，常导致潜在肝毒性药物漏筛，而3D肝球可模拟药物长期暴露效应，精准检测药物代谢中间产物的毒性，降低临床试验风险。例如在某抗结核药物的肝毒性评估中，3D肝球模型成功检测出2D模型未发现的慢性肝损伤风险，为药物剂量优化提供了关键数据。
(2) 在肝脏疾病机制研究中，3D肝球可复刻病理微环境。通过使用疾病供体的原代肝细胞构建3D肝球，能模拟NASH、肝纤维化等疾病的病理状态，助力解析疾病进展过程中的细胞交互机制。研究发现，在肝纤维化3D模型中，肝细胞与肝星状细胞的共培养可重现胶原沉积过程，为抗纤维化药物筛选提供了更贴近临床的模型。
(3) 在再生医学领域，3D肝球与生物打印技术的结合展现出巨大潜力。以色列科研团队利用患者自身干细胞分化的肝细胞构建3D肝球，通过生物打印机逐层构建含血管网络的完整肝脏，成功完成移植手术，术后24小时患者肝功能指标恢复正常，为解决器官短缺与免疫排斥问题提供了新方案。

02    核心刚需：为什么3D肝球培养必须用专属体系？
不同于普通细胞培养，原代肝细胞3D成球对培养环境要求极高，常规耗材与通用培养基完全无法满足需求：
1. 结构适配刚需：普通培养板粘附性强，肝细胞会平铺贴壁，无法聚集形成立体球体；唯有超低吸附材质+U底结构，才能引导细胞自主聚集、均匀成球。
2. 细胞活性刚需：原代肝细胞活性脆弱，普通复苏培养基易导致细胞渗透压失衡、凋亡率高，直接影响后续成球效率。
3. 功能维持刚需：成球前期需要专属培养基助力细胞聚集成型，后期需要维持培养基稳定细胞代谢功能，单一培养基无法兼顾“成球成型”与“长期功能保留”。

基于以上痛点，IPHASE打造一站式闭环3D成球体系，四大核心组件精准分工、高度适配，从源头规避成球失败、模型失效、数据偏差等问题。
 ① 核心载体：U底超低吸附培养板，打造均匀成球基础：成球均匀度、完整性的关键核心，直接决定3D肝球模型质量。
IPHASE U底超低吸附培养板（Ultra-Low Attachment U-Bottom Culture Plate）（Cat NO. 0193601.21/ 0193601.22）采用特殊改性超低吸附材质，彻底杜绝细胞贴壁现象；专属U型底结构可精准聚拢细胞，配合短时离心处理，让细胞快速聚集于孔底中心，单次即可形成大小均一、形态规整、结构致密的肝球，杜绝散球、畸球、大小不一等问题。
【产品优势】
? 超低吸附涂层稳定无脱落，无细胞粘附干扰，无需细胞接种前洗板，即开即用，操作更简便
? U底弧度精准优化，适配3000-5000个/孔最优接种密度，成球成功率高
? 无菌独立包装，批次稳定性强，适配高通量药物筛选与批量实验
? 多规格可选：96孔U底专属成球板，同时配套平底6/12/24/48/96孔板，满足不同实验场景

 ② 活性保障：专用肝细胞复苏培养基，守住细胞活性第一道关：原代肝细胞复苏环节的活性损耗，是很多实验开局翻车的隐形原因。普通培养基复苏易出现细胞肿胀、破裂、活性下降，导致后续成球稀疏、球体易碎。
IPHASE肝细胞专用复苏培养基（Cat NO. 0193311.11/0193301.13）为原代肝细胞专属配比，精准调控渗透压、营养因子与缓冲体系，快速适配冻存细胞复苏后的环境变化，最大限度降低离心、温度波动带来的细胞损伤，有效提升细胞活率与贴壁/成球潜能。
【产品优势】
? 预配完整体系，无需自行配比，开瓶预热即可使用，减少人为误差
? 适配人、猴、犬、大鼠、小鼠全种属原代肝细胞，通用性强
? 有效提升复苏后细胞活率，为后续均匀成球、功能表达筑牢基础

③ 成型关键：3D球状体成球培养基，助力快速规整成球: 细胞复苏接种后，前期聚集成型是3D培养的核心步骤。普通培养基缺乏成球专属营养配比，易出现细胞聚集缓慢、球体松散、空心解体等问题。

IPHASE 3D球状体成球培养基（Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium）（Cat NO. 0194101.13）专为肝细胞自组装成球优化配方，精准调控细胞粘附、聚集相关因子，无需基质胶辅助，即可引导肝细胞自主有序聚集，4-7天左右即可形成结构完整、致密均匀的成熟肝球。培养基可完美适配U底超低吸附板体系，全程无需换液、无需频繁观察，最大程度避免外力干扰球体成型，大幅提升实验稳定性。

 ④ 功能续航：3D球状体维持培养基，长期保留体内生理功能：成球成型并非实验终点，功能稳定维持才是3D模型优于2D模型的核心价值。成球初期完成后，切换专属维持培养基，可精准维系肝细胞核心生理功能。

IPHASE 3D球状体维持培养基（Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium）（Cat NO. 0194101.21）针对性优化代谢营养配比，可有效维持肝球白蛋白分泌、CYP450药物代谢酶表达、胆汁生成等核心功能，功能稳定周期经验证可达至少21天。经qPCR分子验证与蛋白功能检测，使用该培养基维持的3D肝球，ALB、CYP450等核心基因持续高表达，生理相关性高度贴合体内肝脏状态，满足长期药物毒性筛查、疾病进展机制研究、病理模型构建等高端实验需求。

03    3D球状体培养（3D Spheroid Culture）流程
优质3D肝球的形成，离不开“细胞选择-培养体系-操作流程”的协同适配。IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，从原代肝细胞（Primary hepatocytes）、培养体系到试验耗材，把握关键关卡，筛选关键参数，最终形成稳定、适用的3D成球肝细胞。下面以猴原代肝细胞为例，详细描述IPHASE猴肝细胞3D成球培养流程及结果验证。

（一）猴原代肝细胞的复苏从液氮罐中取出猴原代肝细胞冻存管，拧松 1/4 管盖释放压力，迅速拧紧并转移到 37℃的水浴中，顺时针轻柔摇动 90~120 s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。从水浴锅中取出冻存管，用 75%酒精对冻存管表面进行消毒，转移至生物安全柜中。用巴氏吸管将细胞悬液吸出，缓慢滴加至装有 37℃预热的 IPHASE General Hepatocyte Thaw Medium（Cat. 0193311.11） 的无菌15 mL 离心管中，并使用IPHASE General Hepatocyte Thaw Medium（Cat. 0193311.11）润洗冻存管 2~3 次，轻微颠倒混匀。注：保持冻存管盖始终处于水浴锅液面以上，以防造成细胞污染。

设置离心力 100 g，4 ℃离心 5 min后，充分吸弃上清，切勿接触到细胞沉淀。 用IPHASE Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium（Cat. 0194101.13）重悬细胞沉淀。台盼蓝染色计数细胞活率。

（二）猴原代肝细胞的3D球状体培养
（1）细胞浓度调整：采用 IPHASE Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium（Cat. 0194101.13）培养基将细胞悬液浓度调整至 1.5×10^4 cells/mL~2.5×10^4 cells/mL，轻柔吹打混匀，确保细胞浓度均匀一致。
（2）接种：向 IPHASE Ultra-Low Attachment surface,Plates,U Bottom,96well,Sterile (Cat NO. 0193601.21/ 0193601.22)中每孔接种 200μL 细胞悬液，每孔肝细胞数量控制在 3000~5000 cells，接种过程中避免产生气泡，确保每孔接种量均匀。
（3）离心聚集：将接种完成的 U 型底超低吸附培养板放入水平离心机，设置转速为 250g，在室温条件下离心 10 分钟，使肝细胞聚集于孔底部，以促进球状体形成。
（4）培养：轻柔将培养板转移至提前校准完毕的二氧化碳培养箱（37℃、5%二氧化碳、相对湿度≥95%）中，静置培养 4~7 天即可形成稳定的肝细胞球状体，培养期间无需更换培养液。

注：培养过程中严禁晃动培养板，防止肝细胞球状体分散；需定期观察培养情况，避免培养液干涸。

（三）猴原代肝细胞3D球状体的维持与后续试验
（1）球状体维持：肝细胞球状体形成后，可将培养板中的 IPHASE Hepatocyte 3D SpheroidFormation Medium 更换为 IPHASE Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium（Cat NO. 0194101.21），后续每2~3 天更换一次新鲜的维持培养基，以确保球状体的稳定生长与功能维持。

注：更换培养基时操作需轻柔，枪头靠壁缓慢释放培养液，避免冲击肝细胞球状体导致其破裂。

（2）后续实验：维持培养期间，为证明IPHASE 原代肝细胞3D球状体培养技术的成功，IPHASE技术人员以相同的复苏、成球培养流程，同时培养了K0125E086批次食蟹猴原代肝细胞、B0125H018批次比格犬原代肝细胞及SD大鼠原代肝细胞，并考察、验证了其球状体培养7天后上清中白蛋白的分泌情况（下图1）。此外，为更好的考察培养天数对白蛋白分泌的影响，IPHASE技术人员同期将K0125E022批次猴球状体肝细胞延长培养至21天，并对其进行检测（下图2）。

注：肝细胞球状体为三维细胞团，实验操作过程中需格外轻柔，避免因机械损伤导致球状体解体。

图1 不同种属肝细胞球状体白蛋白分泌情况

图2 同批次猴肝细胞球状体培养不同天数白蛋白分泌情况（球状体培养7天、21天）

此外，3D 球状体培养的核心优势是维持肝细胞功能稳定性，而 qPCR（实时荧光定量 PCR）的验证，即实现了从分子层面量化到细胞功能层面的目标，确保了3D 模型生理相关性与可靠性。IPHASE技术人员即以猴球状体肝细胞为样本，验证了培养14天后ALB（白蛋白）、部分CYP40酶等相关基因的表达。成功表明了IPHASE猴3D球状体肝细胞体系保留了肝细胞的核心生理功能，更贴近体内真实状态。

04    IPHASE 产品
综上所述，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，为满足市场对类器官（Organoid）3D球状体培养（3D Spheroid Culture）发展的高需求，现已逐步研发、生产出具有高活性、高纯度且批次间差异小的原代肝细胞（Primary Hepatocytes），包含人原代肝细胞（Primary human hepatocytes）、猴原代肝细胞（Primary Monkey hepatocytes）、犬原代肝细胞（Primary dog hepatocytes）、大鼠原代肝细胞（Primary rat hepatocytes）、小鼠原代肝细胞（Primary mouse hepatocytes）等核心材料，并配有完善复苏培养基（ General Hepatocyte Thaw Medium）、肝细胞3D成球培养基(Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium)、肝细胞3D球状体维持培养基（Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium）及U底超低吸附培养板（Ultra-Low Attachment U-Bottom Culture Plate）等试剂耗材，为药物研发、肝脏疾病机制研究及再生医学领域研究等多领域解锁了技术研究新可能！