脐带血单个核细胞分离方法和注意事项

脐带血是指胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液。脐带血单个核细胞（Cord Blood Mononuclear Cell，CBMC) 分离自正常人胎盘脐带组织，是脐带血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞等，是机体防御系统的一个重要组成部分。

1    原理

单个核细胞的体积、形态和比重与其它细胞不同，在沉降过程中不同比重的细胞会处于不同的分布位置。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。

2    方法

1）  取新鲜抗凝脐带血，按照1：1比例加入RPMI 1640培养基，将血液进行稀释（以降低血液粘稠度），轻柔混匀，备用。

2）  向无菌离心管内加入适量的单个核细胞分离液，将稀释后的脐带血平铺到分离液液面上方（分离液：稀释脐带血=1：2），保持两液面界面清晰。

3）  800g，室温，离心 20min-30min（注：设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档）。

4）  离心结束后，吸弃血浆层，小心吸取CBMC层（即白膜层）并转移至15mL离心管中。离心结束后，管内液面从上至下依次为稀释血浆层、CBMC层、分离液层和红细胞层（见图1）。

图1 稀释脐带血离心前后的分层状态图

5）  向离心管中加入10mL 的RPMI 1640培养基洗涤细胞，250g，室温离心 10min ，弃上清。重复该步骤 1~2 次，即可用于后续试验。

3    注意事项

1）  血液新鲜程度是影响分离效果的关键因素，请尽量使用采集后24h内的血液进行CBMC分离。

2）  为保证细胞的活力，整个操作过程请轻柔，避免对细胞造成机械性的损伤。

3）  为保持细胞状态良好，请尽量缩短整个试验的周期。

4    脐带血单个核细胞分离试剂盒

IPHASE/汇智和源针对人脐带血单个核细胞分离的特点，开发了人脐带血单个核细胞分离试剂盒。该试剂盒包含单个核细胞分离液和洗涤液两个组分，各成分对细胞无毒性，不会影响细胞的原始状态；同时，该试剂盒操作简单便捷，可大大缩短细胞分离时间，分离所得细胞纯度高、状态好、得率高。

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