解决脂溶性维生素检测干扰难题：专业去除脂溶性维生素血清、血浆方案

Keywords：去除维生素A血清；去除维生素A血浆；去除维生素D血清；去除维生素D血浆；去除维生素E血清；去除维生素E血浆；体外诊断；Vitamin A-depleted Serum；Vitamin A-depleted Plasma; Vitamin D-depleted Serum；Vitamin D-depleted Plasma；Vitamin E-depleted Serum；Vitamin E-depleted Plasma；In Vitro Diagnostics; IVD；LC-MS/MS;

体外诊断（In Vitro Diagnostics, IVD）是一种医疗检测方法，广泛应用于各种疾病的预防、诊断、疗效观察等方面，对于提高诊断的准确性、治疗的有效性等情况，具有积极的意义。它通过分析人体的体液、细胞或组织样本，为医生提供了宝贵的诊断信息，进而辅助制定治疗计划。近年来，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）在体外诊断领域的应用日益广泛（如新生儿遗传代谢病筛查、维生素检测、肿瘤标志物检测、治疗药物监测等）。LC-MS/MS法是基于被测生物标志物本身分子量、结构等化学性质的直接分析法，相较于其他检测手段，展现出显著的竞争力。IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，针对IVD维生素类产品开发的LC-MS/MS的检测需求，现已生产出去除维生素A血清（Vitamin A-depleted Serum）、去除维生素A血浆（Vitamin A-depleted Plasma）、去除维生素D血清（Vitamin D-depleted Plasma）、去除维生素D血浆（Vitamin D-depleted Plasma）、去除维生素E血清（Vitamin E-depleted Serum）和去除维生素E血浆（Vitamin E-depleted Plasma）等空白生物基质，是体外诊断脂溶性类维生素客户不可或缺的关键基质之一！

01 空白生物基质的重要性

在质谱法体外诊断分析中，空白生物基质特指不含目标分析物，但保留生物样品本身的基质成分（如蛋白质及其代谢物、脂质、电解质、内源性小分子等）的空白生物样品。

在质谱法检测生物样本内源性物质（如维生素、激素、代谢物等）和常见药物时，空白生物基质的重要性贯穿于检测的全流程，为分析方法的准确性、可靠性提供至关重要的保障。空白生物基质让校准曲线中的标准品与实际样本处于完全一致的基质环境中。此时，标准品的离子化行为（受基质效应影响的程度）与样本中目标物完全相同，确保目标物的信号强度与实际浓度成正比。这是定量准确性的根本前提。在方法验证中，空白生物基质是加标回收实验的基础：通过向空白生物基质中加入已知浓度的标准品，制备质控样品，计算回收率，才能对样品前处理（如萃取、净化）和检测过程的可靠性进行验证。

因此，合适的空白生物基质对于体外诊断试剂盒开发而言具有重要意义！血液类样品是体外诊断最主要的样本类型之一。然而，在临床诊断中研究者发现在一些疾病诊断中，血清（Serum）或血浆（Plasma）中的脂溶性维生素（Fat Soluble Vitamins）的含量会干扰对其他指标的判断。因此，为了准确测定其他物质的含量或指标的变化，需将血清或血浆中的脂溶性维生素去除。

脂溶性维生素(Fat Soluble Vitamins)是不溶于水而溶于脂肪及非极性有机溶剂(如苯、乙醚及氯仿等)的一类维生素，包括维生素A、维生素D、维生素E。这类维生素一般只含有碳、氢、氧三种元素，在食物中多与脂质共存，其在机体内的吸收通常与肠道中的脂质密切相关，可随脂质吸收进入人体并在体内储存(主要在肝脏)，排泄率不高；摄入量过多易引起中毒现象，若摄入量过少则缓慢出现缺乏症状。另外，脂溶性维生素大多稳定性较强。下面为几种脂溶性维生素主要作用。

 维生素A

（1）增强视网膜感光力参与视紫红质的合成，缺乏时视紫红质合成减少，对弱光敏感性降低，在弱光下视物模糊，称为夜盲症；

（2）维持上皮组织结构的完整性和功能参与糖蛋白合成，缺乏时可引起上皮干燥、增生及角化，如皮脂腺角化，出现丘疹；泪腺细胞角化，泪液分泌减少，眼部干燥，称为眼干燥症；

（3）促进机体正常生长发育促进骨细胞的分化，维持成骨细胞及破骨细胞之间的平衡；促进蛋白质、黏多糖及类固醇的合成，缺乏时组织生长发育不良；

（4）促进吞噬细胞和淋巴细胞的功能，促进细胞因子的释放，增强机体免疫力；有效抑制氧自由基的活性，保护细胞免受伤害，具有一定的癌症预防作用。

 维生素D

（1）促进钙、磷在小肠和肾小管的吸收，维持正常稳定的血钙和血磷浓度；

（2）在甲状旁腺素和降钙素的协同下，促进骨钙入血，维持血钙和血磷的平衡；

（3）促使钙沉着于新骨形成部位，促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健。

 维生素E

（1）抗氧化作用能抑制不饱和脂肪酸的氧化，减少过氧化脂质的形成以及对机体生物膜的损害，有抗衰老、抗癌及防止动脉粥样硬化作用；

（2）维持和促进生殖功能使促性腺激素分泌增加，促进精子生成和运动，增加卵泡生长和孕酮的分泌；

（3）参与多种酶活动增强微粒体中混合功能氧化酶的活性，抑制脱氧核糖核酸等分解酶系统，并对含巯基酶有保护作用；

（4）其他维持毛细血管的正常通透性，增加血流量，修复血管壁损伤后的瘢痕，抑制血小板聚集，防止血栓形成；维持骨骼肌、心肌和平滑肌的正常结构和功能。

由上可知，脂溶性维生素主要储存于肝脏组织中，但在个体其余组织或体液中也均有存在，包括作为体外诊断主要样本类型之一的血液样本。血液样本包含全血、血清和血浆三种类型，其中全血由血细胞和血浆组成，应用于临床血液学检查，如红细胞计数、分类和形态学检查等；血浆是血液加入抗凝剂后，经离心分离得到的液体，含有纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白以及各种凝血因子，这些成分共同维持着血液的凝固功能；而血清则是血液在体外自然凝固或加促凝剂后分离出的淡黄色透明液体，它主要含有白蛋白、球蛋白及各种无机离子。

血清或血浆中的生理成分与机体组织间液比较接近，更能真实地反应机体的生理情况，反应其病理改变也更加灵敏。因此，在某些疾病诊断中，为避免脂溶性维生素对于特定疾病或研究的影响，合理的去除血清或血浆中的脂溶性维生素显得尤为重要！

02 去除脂溶性维生素的方法

由上可知，在一些特殊情况下，需采用合理的方法将血清或血浆中的脂溶性维生素去除。目前市面上常见的维生素去除方法如下：

 有机溶剂提取法：取一定量的血浆或血清样本，加入适量的乙酸乙酯或氯仿，震荡，使有机溶剂与维生素D充分混合，离心即可得到不含维生素D的血浆或血清。

【优点】操作简单：步骤较少，易于实施。成本低：所需试剂和设备较为常见。

【缺点】选择性差：可能同时提取其他脂溶性物质。溶剂残留：可能影响后续实验。

 透析法：使用特定孔径的透析膜，置于缓冲液中，维生素D可以通过微孔膜，遂去除。

【优点】温和，不破坏样品中的蛋白质和其他大分子；操作简单，无需复杂设备。

【缺点】耗时长，通常需要数小时至数天；效率低：对小分子去除效果有限。

 固相萃取（SPF）法：使用C18或其它反相柱，先吸附基质中的脂溶性成分，而后用有机溶剂洗脱。

【优点】选择型好，能有效分离脂溶性物质；样品损失少：回收率较高。

【缺点】操作复杂，步骤较多，需优化条件；成本较高，固相萃取柱价格较贵。

 色谱法：使用高效液相色谱（HPLC）或气相色谱（GC）分离并去除维生素D。

【优点】高分离度，能精确分离复杂样品中的特定成分；灵敏度高，适合微量分析。

【缺点】设备昂贵，需用专业仪器；操作复杂，需专业人员操作。

 免疫吸附法：使用抗维生素D的抗体，通过免疫吸附去除基质中的维生素D。

【优点】特异性强，抗体能特异性结合维生素D；高效，去除效果显著。

【缺点】成本高，抗体价格昂贵；操作复杂，需优化实验条件。

 物理吸附法：先用水解试剂使与蛋白质结合的维生素D分离，使其游离，再利用活性炭等物理方法进行吸附去除。

【优点】操作简单，成本较低，无化学污染，广谱吸附性，可调节性强。

【缺点】受环境影响较大，吸附选择性差。

然而，不同的应用场景需要适配不同的去除方法。如以上的有机溶剂提取法、SPF法、色谱法及透析法，都不可能避免的会或多或少的改变血浆的性质。因此，常规获取去除维生素血清/血浆，需采取更温和的手段，即免疫吸附或物理吸附法。IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，以物理吸附为原理，成功去除了血浆/血清中的维生素。并以维生素D为例，进行了去除维生素D血清的LC-MS/MS分析。

03 IPHASE 去除维生素D血清的LC-MS/MS分析

维生素D水平异常往往涉及多系统功能（如视觉、骨骼、凝血、免疫），准确测定结果能为临床决策提供直接依据（如补充剂量调整、疾病风险分层），尤其对特殊人群（早产儿、慢性病患者、长期服药者）的健康管理具有不可替代的意义。利用液相色谱-串联质谱法，检测血清样本中25-OH维生素D2和25-OH维生素D3，是目前体内维生素D检测的主要手段。

《液相色谱-串联质谱法检测25-羟维生素D标准化专家共识》指出：质控样本基质应尽量和患者样本基质保持一致，以减小样本处理和离子化中的基质效应。因此，去除25-羟维生素D的血清是该定量分析中不可或缺的关键材料，其核心意义在于通过消除基质干扰、模拟真实样本环境，为准确、可靠的检测结果提供保障，最终支撑临床诊断、治疗监测和健康评估。

然而，空白生物基质的缺失会直接打破“基质匹配”的平衡，对检测的准确性、可靠性及应用价值造成多重冲击，也是目前公认的行业痛点：

（1）定量准确性显著下降，结果严重偏差；

（2）基质效应无法控制，方法重现性差；

（3）方法验证受阻，可信度无法确认；

（4）临床决策风险剧增，结果失去参考价值；

（5）替代“人工模拟基质”和人工基质无法完全复制生物基质中复杂的小分子网络（如内源性代谢物、脂肪酸），无法消除基质效应，无法模拟分析目标物与血清中大分子可能的相互作用。

不同实验室因使用的替代基质不同，可能导致检测结果缺乏可比性，跨实验室数据无法互认。

鉴于此，IPHASE通过优化物理吸附技术，实现了对血清中维生素D相关化合物的高效去除，得到去除维生素D空白血清，可应用于科研即时检测、IVD试剂研发及部分基层临床调控等方面。

为验证IPHASE产品的合格性，IPHASE技术人员进一步利用LC-MS/MS评估了25-羟维生素D去除效果。图1为去除VD空白基质（红色）和该空白基质中添加1 ng/mL 25-羟基维生素D2（蓝色）的检测结果，保留时间为4.13 min；图2为去除VD空白基质（红色）和该空白基质中添加1 ng/mL 25-羟基维生素D3（蓝色）检测结果，保留时间为4.02 min。前处理方法为液液萃取。结果显示：该产品对VD的去除效果良好，产品中25-羟维生素D的残留大大低于1ng/mL。同时，去除后产品中蛋白浓度，钠、钾、钙、氯等元素含量及脂质浓度，均与去除前相当（分别通过BCA法、ICP/MS法、元素分析仪法及脂质组学方法检测）。

图1 空白血浆去除25-羟基维生素D2及 1ng/mL添加结果图

图2 空白血浆去除25-羟基维生素D3及 1 ng/mL添加结果图

利用去除VD血清产品，构建了校准品（8个浓度点，0.5ng/mL-160ng/mL）和质控品（25-羟维生素D2：5ng/mL、20ng/mL; 25-羟维生素D3：15ng/mL、70ng/mL），并进行了LC-MS/MS分析。表1为利用去除VD血清产品构建的25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的校正品和质控品，进行的LC-MSMS方法验证结果，分析中采用了同位素内标。结果显示，8个校正品的校正曲线和2浓度质控品的精确度结果，均表现良好，且基质干净，可在正常检测水平基础上延伸下限。校正曲线线性范围为0.5~160 ng/mL，25-羟基维生素D2线性拟合R=0.9993，截距为0.0226，25-羟基维生素D3线性拟合R=0.9995，截距为0.0305。图3和图4分别为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3校正曲线拟合结果。

表1 空白血浆制备25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3校正曲线和质控样品结果

* 注：SD为Standard，QC为Quality Control

图3 空白血浆25-羟基维生素D2校正曲线（0.5 ~160ng/mL）

图4 空白血浆25-羟基维生素D3校正曲线（0.5 ~160ng/mL）

04 IPHASE产品

综上，表明IPHASE去除维生素D血清效果优秀，满足需求。IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，针对IVD维生素类产品开发的LC-MS/MS的检测需求，也为满足不同疾病研究或不同产品开发的需求，现已生产出去除维生素A血清（Vitamin A-depleted Serum）、去除维生素A血浆（Vitamin A-depleted Plasma）、去除维生素D血清（Vitamin D-depleted Plasma）、去除维生素D血浆（Vitamin D-depleted Plasma）、去除维生素E血清（Vitamin E-depleted Serum）和去除维生素E血浆（Vitamin E-depleted Plasma）等空白生物基，为不同研究需求的客户提供最完整的产品链，节省时间且节约成本。

除去除脂溶性维生素的血清及血浆产品外，IPHASE常规多种属、多规格的空白血清及血浆产品种类齐全，真正做到了为客户提供“一站式”血液类样本提供服务。同时，IPHASE也含有粪便、尿液、房水等多类型空白生物基质，以供不同需求的客户选用。

IPHASE生产产品均具有以下优势：

合规性 产品来源均由正规渠道获得，来源清晰。

安全性 生产产品来源均经过病原检测，保证产品质量安全。

高质量 生产产品均经过严格的内部质控，且同批次数量多，批次间差异性小。

可定制 可根据客户特殊需求，提供特殊种属、特殊产品的定制服务。