生物实验室的蛋白定量“金标准”：BCA试剂盒完全解析

Keywords：BCA蛋白浓度测定试剂盒；BCA；蛋白定量；标准曲线；BCA Protein Concentration Assay Kit；Bicinchoninic Acid；Protein Assay；Standard Curve;

在蛋白质功能研究的众多方法中，BCA法以其高灵敏度、对去垢剂出色的耐受性及操作简便等特点，成为实验室广泛采用的经典选择，尤其适用于成分复杂的细胞或组织裂解液。鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，开发、生产了BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCA Protein Concentration Assay Kit），为客户的生物试剂蛋白定量提供“一站式”服务。下文将带您快速掌握BCA法的核心原理与IPHASE BCA蛋白浓度测定试剂盒标准化操作。

01 BCA 蛋白浓度测定原理

BCA 法是对经典 Lowry 法的改进，克服了后者步骤繁琐、对干扰物敏感等局限性，具有操作简便快捷、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰性能优良、兼容性能好及经济实用等多种优势。

BCA（Bicinchoninic Acid，2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠）蛋白质定量法是一种广泛应用的蛋白质检测方法，其原理基于蛋白质的还原。蛋白质在碱性条件下可将二价铜离子（Cu2?）还原为一价铜离子（Cu?），随后一价铜离子进一步与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，且该络合物在562 nm波长处具有最大吸光度，通过测量吸光度即可定量蛋白质浓度。具体而言，反应分为两步：第一步，在碱性条件下，蛋白质中的肽键、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基能够还原Cu2?为Cu?。第二步，生成的Cu?与两个BCA分子螯合，形成紫色的Cu?-BCA络合物。该方法灵敏度高、操作简便，且对某些去污剂具有较好的耐受性。

（图片来源于网络）

02 IPHASE BCA蛋白浓度测定试剂盒操作步骤

根据以上原理，IPHASE BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCA Protein Concentration Assay Kit）采用改良型 BCA 法配方，并根据仪器不同，分别提供按照“酶标仪”及“分光光度计”的操作流程，客户可根据现有仪器按需购买、操作。具体操作步骤及数据分析如下：

（1）稀释标准品

使用PBS稀释液将2 mg/mL BSA标准品依次稀释即得到如下浓度系列的标准曲线样品：

将BCA试剂与Cu试剂按50:1的体积比充分混合，即得BCA工作液。

（3）准备待测样本

将您的未知蛋白样本进行适当稀释（建议在预实验中摸索最佳稀释倍数，使测量值落在标准曲线中部）。

（4）加样

①酶标仪法：准确移取标准曲线样品和试验样品各20 μL至96孔酶标板中。推荐每个样品设置2~3个复孔。每孔加入200 μL BCA工作液，加盖封板膜，轻轻振荡混匀。

②分光光度计法：准确移取标准曲线样品和试验样品各100 μL加至标记好的5 mL离心管中。每管加入2 mL BCA工作液，混匀。

（5）孵育与检测

①酶标仪法：37℃恒温孵育30min，冷却至室温后，在3~5min内使用酶标仪读取562 nm波长下的吸光度值。

②分光光度计法: 37℃恒温孵育30min，冷却至室温后，在3~5min内转移至比色皿中，使用分光光度计读取562 nm波长下的吸光度值。

注：IPHASE BCA蛋白浓度测定试剂盒使用分光光度计法可进行50 test；使用微孔法可进行500 test.

03 数据处理与结果分析

（1）推荐使用四参数模型进行曲线拟合。

（2）将样品的吸光值代入回归方程，计算蛋白浓度。

（3）若样品经过稀释，最终蛋白浓度需乘以稀释倍数。

（4）若蛋白浓度超过检测范围（0.02~2 mg/mL），请稀释样品后重新测定。

总而言之，IPHASE BCA蛋白浓度测定试剂盒，其显色稳定性更强、线性范围更宽、重复性更好，可广泛应用于哺乳动物、细菌、组织、细胞裂解液、纯化蛋白等多种样品的蛋白浓度定量测定，是蛋白研究道路上不可或缺的工具。