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Ficoll密度梯度离心法分离PBMC


外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),是指外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞(Lymphocyte)、单核细胞(Monocyte)、树突状细胞(DC)和其他少量细胞。
1     原理
单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其它细胞不同,红细胞和多核白细胞的比重超过1.080,单个核细胞的比重为1.070左右,血小板为1.030左右。因此,可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。
Ficoll密度梯度离心法是分离、纯化PBMC最常用的方法。Ficoll是蔗糖的多聚体,中性,平均分子量400000,当密度为1.2g/mL,未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜,故常用作PBMC分离的分离液。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液比重,离心后漂浮于分离液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分离液中。吸取分层液液面上的白膜层细胞,并进行适当的清洗,就可从外周血中分离到较高纯度的单个核细胞,即PBMC。
2     方法
1)取新鲜抗凝全血,按照1:1比例加入1×稀释洗涤液,将血液进行稀释(以降低血液粘稠度),轻柔混匀,备用。
2)向无菌离心管内加入适量的单个核细胞分离液,将稀释后的血样平铺到分离液液面上方(分离液:稀释全血=1:2),保持两液面界面清晰。 
3)800g,室温,离心 20min-30min(注:设置较慢的加速度和减速度,如果有十档,设为第三档)。 

4)离心结束后,吸弃血浆层,小心吸取PBMC层(即白膜层)并转移至15mL离心管中。离心结束后,管内液面从上至下依次为稀释血浆层、PBMC层、分离液层和红细胞层(见图1)。图1 稀释外周血离心前后的分层状态图

5)向离心管中加入10mL 的1×稀释洗涤液重悬细胞,250g,室温离心 10min ,弃上清。重复该步骤 1~2 次,即可用于后续试验。
3     注意事项
1)不同种属动物单个核细胞的比重有一定差异,请选择合适的分离液进行PBMC的分离。
2)血液新鲜程度是影响分离效果的关键因素,请尽量使用采集后24h内的血液进行PBMC分离。

3)为保证细胞的活力,整个操作过程请轻柔,避免对细胞造成机械性的损伤。
4)为保持细胞状态良好,请尽量缩短整个试验的周期。

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