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酶抑制IC50试验研究原理和试验方法


1    酶抑制研究的重要性

药物代谢的主要场所是肝脏,其中细胞色素 P450(CYP)酶为主要的代谢酶,其亚型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A4参与了体内80%以上的药物代谢。CYP酶是一个多功能的酶系,在体内具有可诱导性和可抑制性。该酶与药物的相互作用能够在所有的体内过程(包括吸收、分布、代谢和排泄)中发生,其中以代谢过程最为突出,约占40%。

近年发现,药物相互作用是临床上产生严重不良反应甚至死亡的主要原因之一。CYP参与的药物相互作用主要包括两种类型:酶抑制(enzyme inhibition)和酶诱导(enzyme induction)。酶抑制是指某些化合物能抑制肝脏药物代谢酶的活性,导致联合用药时一些药物代谢减慢,使得药物的血药浓度上升致毒性;酶诱导是指某些化合物能提高肝脏药物代谢酶的活性,导致合同的药物代谢速率加快,使得原药的血药浓度下降,使其疗效降低或丧失。

图1 药物相互作用模式示意图

为获得更好的治疗效果,联合用药在临床治疗中已非常普遍。然而,在获得更好的疗效的同时,常伴随着由药物-药物相互作用(drug-drug interaction,DDI)引起的不良反应事件的发生。如特非那丁与酮康唑合用时,酮康唑可显著地抑制特非那丁的代谢,造成特非那丁的血药浓度显著升高,可以导致致命的室间心律失常。

图2为采用肝微粒体技术研究西尼地平与几种临床常用药物间的代谢相互作用的实例,结果表明环孢素、红霉素和辛伐他丁在体外表现出对西尼地平代谢的抑制作用,由于三者均是CYP3A的抑制剂或底物,这提示西尼地平与CYP3A的抑制剂或底物合用时可能会出现代谢上的相互作用,使西尼地平的代谢速率降低,西尼地平二氢吡啶环脱氢代谢物生成减少,而原型药物的水平显著提高,这可能会影响临床疗效的正常发挥。

图2 人肝微粒体中几种临床常用药物对西尼地平代谢的影响

如果合用的药物具有潜在的抑制或诱导代谢酶的能力,则前者将受到合用药物的影响,从而使其代谢清除途径发生量化的改变,这种药物相互作用可能会影响治疗效果,增加药物的治疗失败率,甚至诱发不良反应。因此,通过对代谢酶表型的体外研究来判定该化合物的主要代谢酶亚型,已成为药物临床前代谢研究工作中必不可少的一部分。

2    酶抑制IC50研究试剂盒简介

参与药物代谢的CYP450酶主要为CYP1、CYP2和CYP3三个家族,共有7种重要的亚型,分别为CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4。通过考察不同浓度的药物对各种酶亚型的特异性底物的代谢速率的影响,得到半数抑制浓度(IC50),便可评价药物对酶的抑制作用。

公司针对酶抑制IC50研究的需要,以肝微粒体体外温孵法为指导,开发了一款专门用于酶抑制IC50研究的试剂盒,该产品可直接用于药物对CYP450活性抑制的的研究,省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程,大大缩短了实验周期,且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测,符合酶抑制IC50研究试验要求,实验结果准确、可靠、重现性好。

2.1 产品说明

本产品提供了药物酶抑制(IC50)研究的主要试剂,可直接用于药物对CYP450酶的半数抑制浓度(IC50)研究,省去了试剂配制的繁琐过程,且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测,实验结果准确、可靠、重现性好。

根据微粒体种属的不同,可根据实际需求选择人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体中的一种。

2.2 试剂盒优势

便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间,可以直接使用,大大缩短了实验周期。

准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测,实验结果准确、可靠、重现性高。

稳定——本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。

2.3 试剂盒组成


2.4 参考使用方法

2.4.1 试验组

1)冰浴融化试剂盒各组分,置于冰上待用;

2)除微粒体外,将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀,于37℃预孵育5min;

3)将以上混合液195μL/管分装至2.0mL离心管中,于37℃水浴中保温, 5μL/反应加入肝微粒体,吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应,使用秒表计时;

4)于设定孵育时间点,向孵育体系中加入终止液终止反应(如预冷乙腈,预冷乙腈体积:孵育体系体积=1:1)。

例:200μL孵育体系配制:

注:

a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%;

b.若实际需要n个孵育体系,则需配置n+1个体系;

c.本实验需设置系列受试物浓度,通常为0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L;

d.参考使用方法仅为使用范例,需根据实际试验需求进行调整。

2.4.2对照组:

无A、B液组:反应体系中不加A液和B液,其它组分加入量不变,缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐。

2.4.3结果计算:

用各特异性探针底物的代谢物的生成速率反映微粒体孵育体系中各CYP450亚型酶的活性;设定只含代谢底物的孵育体系中各亚型酶活性为100%,作为对照;样品中代谢物生成速率相对于对照组生成速率的百分比,作为各亚型酶的剩余活性。

活性剩余百分比 = (某浓度样品底物代谢物生成速率/零浓度样品代谢物生成速率) × 100%

2.4.4使用注意事项:

1)试验开始前,请自行准备2.0mL离心管、不同规格枪头、37℃水浴锅等;

2)本产品仅供科研使用,不能用于人体及动物的治疗或临床诊断;

3)使用前,需于冰浴条件下解冻并混合均匀;

4)于-70℃冰箱冷冻保存,切勿反复冻融;

5)在使用过程中,也可根据实际实验需求调整试剂盒使用方法和各组分的加入量;

6)因CYP2B6和CYP2C19在体外没有绝对特异的抑制剂可用,故结果分析还需结合其它结果进行,如重组酶法的结果。

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